【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ， Evans 和 Long 牛垂體前葉的提取物可以刺激正常大鼠的生長(zhǎng) [5]，很快又發(fā)現(xiàn)此提取物 可以使去垂體的大鼠保持生長(zhǎng) [6]。促進(jìn)生長(zhǎng)的提取物發(fā)現(xiàn)可以刺激合成代謝效應(yīng)，降低尿中氮、鈣和磷的排泄 [7,8]。尿中這些元素的測(cè)定提供了一個(gè)簡(jiǎn)便的生物活性檢測(cè)方法，并用于在垂體提取物中分離活性組分。 1944 年 Li 和 Evans 第一次從牛垂體中分離現(xiàn)在已知為生長(zhǎng)激素的多肽激素 [9]。 由于牛生長(zhǎng)激素沒(méi)有成功的促進(jìn)人的長(zhǎng)高 [10]，因此人們開始從尸體或去除垂體的乳腺按患者的垂體中提取人生長(zhǎng)激素 [1113]。在臨床試驗(yàn)中，人和猴子的生長(zhǎng)激素產(chǎn)生了合成代謝，并刺激了長(zhǎng)高 [1415]。猿和非猿的生長(zhǎng)激素的的生物 化學(xué)差異被鑒別出來(lái)，同時(shí)解釋了生理效應(yīng)的物種特異性 [14]。 在 1957 和 1985 年之間，從尸體垂體提取的人生長(zhǎng)激素被用于很多生長(zhǎng)激素缺乏兒童的激素替代治療中 [16]。在此期間，生長(zhǎng)激素治療發(fā)現(xiàn)是有效并沒(méi)有什么副反應(yīng)。然而，人垂體生長(zhǎng)激素是稀缺和昂貴的。其他治療的應(yīng)用開發(fā)，或人生長(zhǎng)激素的細(xì)胞作用機(jī)理的研究時(shí)不可能的。 科學(xué)的進(jìn)步改變了人生長(zhǎng)激素領(lǐng)域的發(fā)展。人生長(zhǎng)激素的 DNA 被克隆到了細(xì)菌 2 質(zhì)粒上 [17]，從此開辟了基因工程人生長(zhǎng)激素商業(yè)化的道路。 1985 年被報(bào)道 [18]發(fā)現(xiàn)兒童期使用人生長(zhǎng)激素的兒童，成年后發(fā)現(xiàn)罹患 致命的神經(jīng)退行性疾病 克雅病， 因此美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（ FDA）在上世紀(jì) 80 年代命令停止一切提取自死人腦垂體的 hGH，并不準(zhǔn) 應(yīng)用于人體上。 這一事件促發(fā)了重組人生長(zhǎng)激素在臨床上商業(yè)化使用。隨著在細(xì)菌中大規(guī)模生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素，人生長(zhǎng)激素的供應(yīng)不再成為人體或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行各種治療研究的限制。 20 世紀(jì) 80 年代，基因工程興起。 1981 年 Genentech 公司利用大腸桿菌（ E. Coli）包涵體技術(shù)研制出含 192 氨基酸的基因重組人生長(zhǎng)激素 ——MetrhGH。與天然 hGH相比 ，在 N末端多了一個(gè)蛋氨酸殘基，又稱為 somatrem (Protropin174。)。 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展， 1986 年 通過(guò)基因重組技術(shù)合成出 含天然序列的重組人生長(zhǎng)激素 。 上世紀(jì) 90 年代人們純化了人生長(zhǎng)激素受體蛋白，并克隆了基因 [19,20]。通過(guò) X 射線晶體衍射解析了人生長(zhǎng)激素受體蛋白和人生長(zhǎng)激素的相互作用的三維結(jié)構(gòu) [21]。生長(zhǎng)激素受體結(jié)構(gòu)的知識(shí)對(duì)生長(zhǎng)激素信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理的研究提供了新的視野和方向。直接單位點(diǎn)突變技術(shù)被用于對(duì)生長(zhǎng)激素配體 受體相互作用的研究 [22]，分子方法也被用于生長(zhǎng)激素受體激動(dòng)劑的設(shè)計(jì)。 人生 長(zhǎng)激素基因 簇 大約有 66,500 個(gè)堿基，位于第 17 染色體的長(zhǎng)臂上 [23]。由 GHN（正常生長(zhǎng)激素基因）， CSL（類 絨毛膜生長(zhǎng)激素 ）， CSA（ 絨毛膜生長(zhǎng)激素 A），GHV（生長(zhǎng)激素變體基因，也是胎盤生長(zhǎng)激素）和 CSB（ 絨毛膜生長(zhǎng)激素 B） 5 個(gè)基因家族組成。 GHN 和 GHV 有時(shí)也稱為 GH1 和 GH2。 絨毛膜生長(zhǎng)激素 也是 胎盤催乳素 基因。這 5 個(gè)基因的 DNA 序列高度同源。因此猜測(cè)生長(zhǎng)激素基因家族通過(guò)基因復(fù)制而產(chǎn)生的。 只有 GHN 是正常健康必須的。切除或突變 GHN 基因引起 IA 型生長(zhǎng)激素缺乏，這是最嚴(yán)重的生長(zhǎng)激素缺乏。具有這個(gè)缺陷的個(gè)體不能產(chǎn)生內(nèi)源性生長(zhǎng)激素。在出生或出生 3~6 個(gè)月引起有明顯的重度低血糖和生長(zhǎng)延緩 [24]。這些患者初始對(duì)生長(zhǎng)激素替代有響應(yīng)，但治療 1 年內(nèi)由于生長(zhǎng)激素抗體產(chǎn)生而抑制了生長(zhǎng)。 GHN 基因在垂體前葉表達(dá)，是在兒童和成年人中循環(huán)的主要形式 [25]。生長(zhǎng)激素是分泌蛋白，它的合成是一個(gè)含 26 個(gè)氨基酸的激素前體。當(dāng)生長(zhǎng)激素跨過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到貯藏粒中時(shí)信號(hào)肽被切除。 GHN 表達(dá)的生長(zhǎng)激素是一個(gè) 22kDa， 191 個(gè)氨基酸的單鏈多肽。生長(zhǎng)激素生物活性構(gòu)象含有兩個(gè)二硫鍵橋 。 22kDa GHN 基因產(chǎn)物在人的肝臟和受體結(jié) 3 合，并刺激 IGF1 的產(chǎn)生和長(zhǎng)高。 所有的人生長(zhǎng)激素都是采用注射的方式給藥。皮下和肌內(nèi)注射時(shí)等價(jià)的 [26]。因?yàn)橛休^小的疼痛感，皮下注射更好。腹部的皮下注射比大腿的皮下注射有更高的生長(zhǎng)激素血清濃度，然而刺激 IGF1 的水平相當(dāng) [27]。在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)生長(zhǎng)激素和高親和的生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白（ GHBP）結(jié)合，和這個(gè)蛋白結(jié)合延長(zhǎng)了生長(zhǎng)激素在循環(huán)系統(tǒng)的半衰期。給藥的時(shí)間不影響血清中生長(zhǎng)激素的水平，晚上給藥模擬了生理的生長(zhǎng)激素峰值 [28]。生長(zhǎng)激素的清除半衰期大約在 2 到 3 小時(shí) 之間。通過(guò)在肝臟和腎臟的代謝而清除的，成年人比兒童清除速率更快 [29]。 人生長(zhǎng)激素是非糖基化的，因此目前國(guó)際上已經(jīng)批準(zhǔn)上市的重組人生長(zhǎng)激素主要是由細(xì)菌（ E. Coli）生產(chǎn)的，如 Genentech 的 Nutropin174。， Eli Lilly 的 Humatrope174。，Novo Nordisk 的 Norditrope174。等。也有用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的，如 Serono 的 Saizen174。；以及由酵母生產(chǎn)的，如 LG 的 Valtropin174。 表 1 列出了目前主要重組人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)商和在美國(guó)和中國(guó)批準(zhǔn)上市的時(shí)間。我國(guó)內(nèi)已上市產(chǎn)品均是由大腸桿菌（ E. Coli）生產(chǎn)的。 表 1 主要重組人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)商 生產(chǎn)商 商品名 美國(guó)批準(zhǔn)日期 中國(guó)批準(zhǔn)日期 美國(guó)禮來(lái)制藥 Humatrope 1987 年 3 月 2020 年 6 月 美國(guó)基因技術(shù)公司 Nutropin 1993 年 11 月 / 輝瑞制藥 Genotropin 1995 年 8 月 2020 年 7 月 默克雪蘭諾 Saizen 1996 年 10 月 2020 年 4 月 諾和諾德制藥有限公司 Norditropin Flexpro 2020 年 6 月 2020 年 6 月 山德士制藥有限公司 Omnitrope 2020 年 5 月 / 上海聯(lián)合賽生物工程有限公司 珍怡 / 1999 年 7 月 長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司 賽增 / 1998 年 安徽安科生物工程股份有限公司 安蘇萌 / 1999 年 *methGH 已下市 重組人生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中的表達(dá)有兩種形式，第一種形式是甲硫氨酸生長(zhǎng)激素 mhGH，他和天然生長(zhǎng)激素有一個(gè)氨基酸的差異，在 N 端多了一個(gè)甲硫氨酸，美國(guó)基因技術(shù)公司和諾和諾德最初的產(chǎn)品就是 mhGH，目前這種形式的重組人生長(zhǎng)激 4 素已經(jīng)下市。第二種形式是真實(shí)的人生長(zhǎng)激素。一些研究表明甲硫氨酸生長(zhǎng)激素比真實(shí)的人生長(zhǎng)激素產(chǎn)生較高的抗體 [30]，美國(guó)禮來(lái)公司的 Humatrope 是第一個(gè)批準(zhǔn)的和天然序列一致的重組人生長(zhǎng)激素 [31]。甲硫氨酸殘基和細(xì)菌蛋白結(jié)合的痕量的人生長(zhǎng)激素比單純的甲硫氨酸人生長(zhǎng)激素產(chǎn)生更高的免疫原性，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)純化而緩解?？贵w的產(chǎn)生很少干擾人生長(zhǎng)激素的生物活性，因?yàn)榭贵w的親和性和濃度均較低 [31]。生長(zhǎng)激素抗體水平使得市場(chǎng)不再追隨甲硫氨酸人生長(zhǎng)激素。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的人生長(zhǎng)激素有非常低的免疫 原性 [32]。目前主要的重組人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)商均提供的是和天然人生長(zhǎng)激素一致的重組人生長(zhǎng)激素。大多數(shù)生產(chǎn)商采用的是大腸桿菌系統(tǒng)，因?yàn)槟壳芭鷾?zhǔn)上市的產(chǎn)品證明大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的人生長(zhǎng)激素的免疫原性并未對(duì)產(chǎn)品的有效性和安全性產(chǎn)生不利的影響采用大腸桿菌系統(tǒng)是最經(jīng)濟(jì)的，而且大腸桿菌系統(tǒng)已經(jīng)是比較成熟的基因工程技術(shù)，上游構(gòu)建和下游純化均有比較成熟的技術(shù)，工藝控制比較穩(wěn)定。 重組人生長(zhǎng)激素是一個(gè)單鏈多肽激素，通常以生物活性的單體存在，但正像大家所知的他易聚集為二聚體，并在熱和機(jī)械應(yīng)力下（如制備過(guò)程中的搖動(dòng)等）轉(zhuǎn)化為多聚體 而失去活性。 生長(zhǎng)激素的藥物配方趨向于不穩(wěn)定，尤其在溶液中，生長(zhǎng)激素容易生成降解產(chǎn)物，如脫氨和氧化產(chǎn)物。主要的降解反應(yīng)是 1）直接水解脫氨或通過(guò)環(huán)狀琥珀酰亞胺中間體而形成 LasphGH， LisoasphGH， DasphGH 以及 DisoasphGH； 2）在 14 和125 位上甲硫氨酸殘基的氧化； 3）聚集； 4）肽骨架的截?cái)唷? 凍干狀態(tài)以及溶液狀態(tài)的生長(zhǎng)激素的主要降解產(chǎn)物是脫氨組分。脫氨發(fā)生在 149的 Asn 天冬酰胺上，在 152 的天冬酰胺殘基上也會(huì)產(chǎn)生少量的脫氨。在溶液中人生長(zhǎng)激素在 14 和 125 位上 的甲硫氨酸極易氧化。溶液中 hGH 氧化形成亞砜主要原因是配方中的溶解氧。蒸餾水中氧氣的溶解度大約是 200uM，而對(duì)于 4IU/ml 的生長(zhǎng)激素來(lái)說(shuō)，其濃度相當(dāng)于 60nM。在正常的儲(chǔ)存條件下，溶解氧的量超過(guò)了 3000 倍生長(zhǎng)激素的化學(xué)計(jì)量，所以是不能通過(guò)塞蓋或包裝前對(duì)緩沖溶液除氣來(lái)解決溶解氧的問(wèn)題。 很多降解反應(yīng)多可以通過(guò)凍干從蛋白質(zhì)中移走水分而顯著降低，所以現(xiàn)在生長(zhǎng)激素通常都是凍干的，在 4℃以凍干形式儲(chǔ)存的凍干劑型，使用前再重新溶解，大部分的商品重組人生長(zhǎng)激素是凍干形式的。 5 除了常見(jiàn)的凍干形式制劑外，考慮到使用方便和患者的依從性，人生長(zhǎng)激素的溶液制劑和緩釋制劑的研究也很多。目前國(guó)際上諾和諾德和美國(guó)基因技術(shù)公司均有溶液劑型的生長(zhǎng)激素上市，但由于人生長(zhǎng)激素在溶液中很不穩(wěn)定，因此貨架期要比凍干劑型短很多，而且對(duì)運(yùn)輸?shù)囊笠脖容^高，溶液劑型對(duì)溫度的敏感性比凍干劑型高很多。 從二十世紀(jì)八九十年代至今，普遍認(rèn)為在冷凍干燥過(guò)程中冷凍和干燥都會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。 Dean[33]認(rèn)為在冷凍過(guò)程中缺少保護(hù)劑的情況下，蛋白質(zhì)將失去活性；而脫水過(guò)程本身能使蛋白質(zhì)損傷，從而復(fù)水后蛋白失去活性。保護(hù)劑的作 用一般認(rèn)為是通過(guò)與蛋白的氫鍵作用而保護(hù)了蛋白由于失去水分而裸露的基團(tuán)。保護(hù)劑的濃度和凍干速率相關(guān)，由于對(duì)于藥物制劑來(lái)說(shuō)保護(hù)劑的濃度不能過(guò)高，所以要有較大的凍干速率。 人生長(zhǎng)激素制劑的穩(wěn)定性是和水分以及氧有密切的關(guān)系，在低的水分含量以及最小氧的存在下制劑的穩(wěn)定性最好 [34]。但是在不加保護(hù)劑的情況下，如果單純降低水分含量可能適得其反，因?yàn)榈鞍兹绻プ詈笠粚铀值谋Ｗo(hù)，將因?yàn)榛鶊F(tuán)的暴露而聚集變性。有報(bào)道 [35]人生長(zhǎng)激素在含水量 %時(shí)完全變性，而在含水量 %時(shí)沒(méi)有變性。所以凍干過(guò)程應(yīng)該加入合適的保護(hù)劑 以及其他輔料，并且含水量不是越低越好。較少氧對(duì)蛋白的氧化，可以通過(guò)充氮?dú)鈦?lái)保護(hù) [36]。 冷凍干燥過(guò)程中的降溫速率的選擇與保護(hù)劑的濃度有關(guān)，如果保護(hù)劑濃度很高，以不太大的降溫速率就能使溶液以玻璃態(tài)固化。很多人認(rèn)為快速冷凍有益于生物活性，因?yàn)榭焖倮鋬隹梢詼p少緩沖液結(jié)晶引起的 pH 變化，減低蛋白質(zhì)局部高離子強(qiáng)度的接觸時(shí)間，減少變性可能發(fā)生的時(shí)間。但是很多證據(jù)表明凍融和冷凍干燥后，快速冷凍對(duì)蛋白的活性回收不利，并對(duì)貯藏期凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性也有影響 [37]。用磷酸緩沖液和甘露醇作為賦形劑體系，在 ~ 時(shí)，冷 凍速率對(duì)人生長(zhǎng)激素的可溶性聚合物形成的影響檢測(cè)不到，可是對(duì)不溶性聚合物形成的影響是顯著的，冷凍速率越高聚合物越多。不溶性聚合物的形成被冷凍前的低 pH 加速。 凍干溶液的 pH 很重要，對(duì)脫氨的影響較大。選用不同的緩沖溶液對(duì) pH 的要求也不一樣。當(dāng)選用磷酸鹽作為緩沖液時(shí)，在較低的 pH（ ）下，有較少的脫氨組分，但在此 pH 下較易產(chǎn)生聚集 [38]。人生長(zhǎng)激素溶液劑型就是選用較低的 pH，添加非離子表面活性劑防止聚集。 6 人生長(zhǎng)激素最常用的凍干保護(hù)劑是甘氨酸和甘露醇。兩種配方比很重要，根據(jù)劑量的不同兩種物質(zhì)加入的比例是不同 一樣的。甘露醇作為保護(hù)劑和甘氨酸一起起到穩(wěn)定凍干制劑的作用。為了保證重新溶解后人生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定，也有在溶解水中加入非離子表面活性劑來(lái)增加溶液的物理穩(wěn)定性，如諾和諾德的 NorditropinSimpleXx，在溶解水中加入泊洛沙姆 188 以增加物理穩(wěn)定性。表 2 列出了價(jià)格典型的商品化重組人生長(zhǎng)激素的配方。 表 2 常見(jiàn)商品化重組人生長(zhǎng)激素的凍干配方 * 商品名 劑型 規(guī)格 賦形劑 緩沖鹽 rhGH 甘氨酸 甘露醇 蔗糖 NaH2PO4 Na2HPO4 pH Genotropin 凍干劑型 0 / / Humatrope 15 5 5 25 / 0 18 6 6 18 / 0 Nutropin 15 5 45 / Saizen 15 5 / / *來(lái)源于 FDA 網(wǎng)站相關(guān)產(chǎn)品的說(shuō)明書 表 2 中可以看到大多數(shù)上市產(chǎn)品采用的甘氨酸和甘露醇配方系統(tǒng)。本文討論的產(chǎn)品就是采用冷凍干燥技術(shù)制備的凍干粉針劑型，也采用和上市產(chǎn)品同樣的甘氨酸和甘露醇體系，配方均得到批準(zhǔn)，長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，凍干劑型和溶液劑型相比較在貨架期要穩(wěn)定的很多，這也是目前市場(chǎng)上還是主要以凍干劑型為主的原因。 場(chǎng)地變更的原因 注射用重組人生長(zhǎng)激素是上海聯(lián)合賽 生物工程有限公司已上市十多年的老產(chǎn)品，隨著市場(chǎng)的擴(kuò)大，原生產(chǎn)車間已不能滿足市場(chǎng)需求，為此在原址上新建了注射用重組人生長(zhǎng)激素生產(chǎn)車間，用于 注射用重組人生長(zhǎng)激素 的生產(chǎn)。由于在原址上新建，原質(zhì)量檢測(cè)、原輔材料采購(gòu)和儲(chǔ)存，以及質(zhì)量保證系統(tǒng)均采用原來(lái)的系統(tǒng)，檢測(cè)、原輔材料和質(zhì)量保證系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)較低。 本次是在原廠址增建了一個(gè)注射用重組人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)線，包括了原液生產(chǎn)車間和制劑生產(chǎn)車間，對(duì)于本次新建車間經(jīng)歷了下面幾個(gè)階段。 表 3 新