【文章內(nèi)容簡介】 ， Evans 和 Long 牛垂體前葉的提取物可以刺激正常大鼠的生長 [5]，很快又發(fā)現(xiàn)此提取物 可以使去垂體的大鼠保持生長 [6]。促進生長的提取物發(fā)現(xiàn)可以刺激合成代謝效應(yīng)，降低尿中氮、鈣和磷的排泄 [7,8]。尿中這些元素的測定提供了一個簡便的生物活性檢測方法，并用于在垂體提取物中分離活性組分。 1944 年 Li 和 Evans 第一次從牛垂體中分離現(xiàn)在已知為生長激素的多肽激素 [9]。 由于牛生長激素沒有成功的促進人的長高 [10]，因此人們開始從尸體或去除垂體的乳腺按患者的垂體中提取人生長激素 [1113]。在臨床試驗中，人和猴子的生長激素產(chǎn)生了合成代謝，并刺激了長高 [1415]。猿和非猿的生長激素的的生物 化學(xué)差異被鑒別出來，同時解釋了生理效應(yīng)的物種特異性 [14]。 在 1957 和 1985 年之間，從尸體垂體提取的人生長激素被用于很多生長激素缺乏兒童的激素替代治療中 [16]。在此期間，生長激素治療發(fā)現(xiàn)是有效并沒有什么副反應(yīng)。然而，人垂體生長激素是稀缺和昂貴的。其他治療的應(yīng)用開發(fā)，或人生長激素的細胞作用機理的研究時不可能的。 科學(xué)的進步改變了人生長激素領(lǐng)域的發(fā)展。人生長激素的 DNA 被克隆到了細菌 2 質(zhì)粒上 [17]，從此開辟了基因工程人生長激素商業(yè)化的道路。 1985 年被報道 [18]發(fā)現(xiàn)兒童期使用人生長激素的兒童，成年后發(fā)現(xiàn)罹患 致命的神經(jīng)退行性疾病 克雅病， 因此美國食品藥品監(jiān)督管理局（ FDA）在上世紀 80 年代命令停止一切提取自死人腦垂體的 hGH，并不準 應(yīng)用于人體上。 這一事件促發(fā)了重組人生長激素在臨床上商業(yè)化使用。隨著在細菌中大規(guī)模生產(chǎn)人生長激素，人生長激素的供應(yīng)不再成為人體或?qū)嶒炇疫M行各種治療研究的限制。 20 世紀 80 年代，基因工程興起。 1981 年 Genentech 公司利用大腸桿菌（ E. Coli）包涵體技術(shù)研制出含 192 氨基酸的基因重組人生長激素 ——MetrhGH。與天然 hGH相比 ，在 N末端多了一個蛋氨酸殘基，又稱為 somatrem (Protropin174。)。 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展， 1986 年 通過基因重組技術(shù)合成出 含天然序列的重組人生長激素 。 上世紀 90 年代人們純化了人生長激素受體蛋白，并克隆了基因 [19,20]。通過 X 射線晶體衍射解析了人生長激素受體蛋白和人生長激素的相互作用的三維結(jié)構(gòu) [21]。生長激素受體結(jié)構(gòu)的知識對生長激素信號傳導(dǎo)機理的研究提供了新的視野和方向。直接單位點突變技術(shù)被用于對生長激素配體 受體相互作用的研究 [22]，分子方法也被用于生長激素受體激動劑的設(shè)計。 人生 長激素基因 簇 大約有 66,500 個堿基，位于第 17 染色體的長臂上 [23]。由 GHN（正常生長激素基因）， CSL（類 絨毛膜生長激素 ）， CSA（ 絨毛膜生長激素 A），GHV（生長激素變體基因，也是胎盤生長激素）和 CSB（ 絨毛膜生長激素 B） 5 個基因家族組成。 GHN 和 GHV 有時也稱為 GH1 和 GH2。 絨毛膜生長激素 也是 胎盤催乳素 基因。這 5 個基因的 DNA 序列高度同源。因此猜測生長激素基因家族通過基因復(fù)制而產(chǎn)生的。 只有 GHN 是正常健康必須的。切除或突變 GHN 基因引起 IA 型生長激素缺乏，這是最嚴重的生長激素缺乏。具有這個缺陷的個體不能產(chǎn)生內(nèi)源性生長激素。在出生或出生 3~6 個月引起有明顯的重度低血糖和生長延緩 [24]。這些患者初始對生長激素替代有響應(yīng)，但治療 1 年內(nèi)由于生長激素抗體產(chǎn)生而抑制了生長。 GHN 基因在垂體前葉表達，是在兒童和成年人中循環(huán)的主要形式 [25]。生長激素是分泌蛋白，它的合成是一個含 26 個氨基酸的激素前體。當(dāng)生長激素跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運到貯藏粒中時信號肽被切除。 GHN 表達的生長激素是一個 22kDa， 191 個氨基酸的單鏈多肽。生長激素生物活性構(gòu)象含有兩個二硫鍵橋 。 22kDa GHN 基因產(chǎn)物在人的肝臟和受體結(jié) 3 合，并刺激 IGF1 的產(chǎn)生和長高。 所有的人生長激素都是采用注射的方式給藥。皮下和肌內(nèi)注射時等價的 [26]。因為有較小的疼痛感，皮下注射更好。腹部的皮下注射比大腿的皮下注射有更高的生長激素血清濃度，然而刺激 IGF1 的水平相當(dāng) [27]。在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)生長激素和高親和的生長激素結(jié)合蛋白（ GHBP）結(jié)合，和這個蛋白結(jié)合延長了生長激素在循環(huán)系統(tǒng)的半衰期。給藥的時間不影響血清中生長激素的水平，晚上給藥模擬了生理的生長激素峰值 [28]。生長激素的清除半衰期大約在 2 到 3 小時 之間。通過在肝臟和腎臟的代謝而清除的，成年人比兒童清除速率更快 [29]。 人生長激素是非糖基化的，因此目前國際上已經(jīng)批準上市的重組人生長激素主要是由細菌（ E. Coli）生產(chǎn)的，如 Genentech 的 Nutropin174。， Eli Lilly 的 Humatrope174。，Novo Nordisk 的 Norditrope174。等。也有用哺乳動物細胞生產(chǎn)的，如 Serono 的 Saizen174。；以及由酵母生產(chǎn)的，如 LG 的 Valtropin174。 表 1 列出了目前主要重組人生長激素的生產(chǎn)商和在美國和中國批準上市的時間。我國內(nèi)已上市產(chǎn)品均是由大腸桿菌（ E. Coli）生產(chǎn)的。 表 1 主要重組人生長激素的生產(chǎn)商 生產(chǎn)商 商品名 美國批準日期 中國批準日期 美國禮來制藥 Humatrope 1987 年 3 月 2020 年 6 月 美國基因技術(shù)公司 Nutropin 1993 年 11 月 / 輝瑞制藥 Genotropin 1995 年 8 月 2020 年 7 月 默克雪蘭諾 Saizen 1996 年 10 月 2020 年 4 月 諾和諾德制藥有限公司 Norditropin Flexpro 2020 年 6 月 2020 年 6 月 山德士制藥有限公司 Omnitrope 2020 年 5 月 / 上海聯(lián)合賽生物工程有限公司 珍怡 / 1999 年 7 月 長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司 賽增 / 1998 年 安徽安科生物工程股份有限公司 安蘇萌 / 1999 年 *methGH 已下市 重組人生長激素在大腸桿菌中的表達有兩種形式，第一種形式是甲硫氨酸生長激素 mhGH，他和天然生長激素有一個氨基酸的差異，在 N 端多了一個甲硫氨酸，美國基因技術(shù)公司和諾和諾德最初的產(chǎn)品就是 mhGH，目前這種形式的重組人生長激 4 素已經(jīng)下市。第二種形式是真實的人生長激素。一些研究表明甲硫氨酸生長激素比真實的人生長激素產(chǎn)生較高的抗體 [30]，美國禮來公司的 Humatrope 是第一個批準的和天然序列一致的重組人生長激素 [31]。甲硫氨酸殘基和細菌蛋白結(jié)合的痕量的人生長激素比單純的甲硫氨酸人生長激素產(chǎn)生更高的免疫原性，這個問題可以通過純化而緩解。抗體的產(chǎn)生很少干擾人生長激素的生物活性，因為抗體的親和性和濃度均較低 [31]。生長激素抗體水平使得市場不再追隨甲硫氨酸人生長激素。哺乳動物細胞的人生長激素有非常低的免疫 原性 [32]。目前主要的重組人生長激素的生產(chǎn)商均提供的是和天然人生長激素一致的重組人生長激素。大多數(shù)生產(chǎn)商采用的是大腸桿菌系統(tǒng)，因為目前批準上市的產(chǎn)品證明大腸桿菌系統(tǒng)表達的人生長激素的免疫原性并未對產(chǎn)品的有效性和安全性產(chǎn)生不利的影響采用大腸桿菌系統(tǒng)是最經(jīng)濟的，而且大腸桿菌系統(tǒng)已經(jīng)是比較成熟的基因工程技術(shù)，上游構(gòu)建和下游純化均有比較成熟的技術(shù)，工藝控制比較穩(wěn)定。 重組人生長激素是一個單鏈多肽激素，通常以生物活性的單體存在，但正像大家所知的他易聚集為二聚體，并在熱和機械應(yīng)力下（如制備過程中的搖動等）轉(zhuǎn)化為多聚體 而失去活性。 生長激素的藥物配方趨向于不穩(wěn)定，尤其在溶液中，生長激素容易生成降解產(chǎn)物，如脫氨和氧化產(chǎn)物。主要的降解反應(yīng)是 1）直接水解脫氨或通過環(huán)狀琥珀酰亞胺中間體而形成 LasphGH， LisoasphGH， DasphGH 以及 DisoasphGH； 2）在 14 和125 位上甲硫氨酸殘基的氧化； 3）聚集； 4）肽骨架的截斷。 凍干狀態(tài)以及溶液狀態(tài)的生長激素的主要降解產(chǎn)物是脫氨組分。脫氨發(fā)生在 149的 Asn 天冬酰胺上，在 152 的天冬酰胺殘基上也會產(chǎn)生少量的脫氨。在溶液中人生長激素在 14 和 125 位上 的甲硫氨酸極易氧化。溶液中 hGH 氧化形成亞砜主要原因是配方中的溶解氧。蒸餾水中氧氣的溶解度大約是 200uM，而對于 4IU/ml 的生長激素來說，其濃度相當(dāng)于 60nM。在正常的儲存條件下，溶解氧的量超過了 3000 倍生長激素的化學(xué)計量，所以是不能通過塞蓋或包裝前對緩沖溶液除氣來解決溶解氧的問題。 很多降解反應(yīng)多可以通過凍干從蛋白質(zhì)中移走水分而顯著降低，所以現(xiàn)在生長激素通常都是凍干的，在 4℃以凍干形式儲存的凍干劑型，使用前再重新溶解，大部分的商品重組人生長激素是凍干形式的。 5 除了常見的凍干形式制劑外，考慮到使用方便和患者的依從性，人生長激素的溶液制劑和緩釋制劑的研究也很多。目前國際上諾和諾德和美國基因技術(shù)公司均有溶液劑型的生長激素上市，但由于人生長激素在溶液中很不穩(wěn)定，因此貨架期要比凍干劑型短很多，而且對運輸?shù)囊笠脖容^高，溶液劑型對溫度的敏感性比凍干劑型高很多。 從二十世紀八九十年代至今，普遍認為在冷凍干燥過程中冷凍和干燥都會引起蛋白質(zhì)的變性。 Dean[33]認為在冷凍過程中缺少保護劑的情況下，蛋白質(zhì)將失去活性；而脫水過程本身能使蛋白質(zhì)損傷，從而復(fù)水后蛋白失去活性。保護劑的作 用一般認為是通過與蛋白的氫鍵作用而保護了蛋白由于失去水分而裸露的基團。保護劑的濃度和凍干速率相關(guān)，由于對于藥物制劑來說保護劑的濃度不能過高，所以要有較大的凍干速率。 人生長激素制劑的穩(wěn)定性是和水分以及氧有密切的關(guān)系，在低的水分含量以及最小氧的存在下制劑的穩(wěn)定性最好 [34]。但是在不加保護劑的情況下，如果單純降低水分含量可能適得其反，因為蛋白如果失去最后一層水分的保護，將因為基團的暴露而聚集變性。有報道 [35]人生長激素在含水量 %時完全變性，而在含水量 %時沒有變性。所以凍干過程應(yīng)該加入合適的保護劑 以及其他輔料，并且含水量不是越低越好。較少氧對蛋白的氧化，可以通過充氮氣來保護 [36]。 冷凍干燥過程中的降溫速率的選擇與保護劑的濃度有關(guān)，如果保護劑濃度很高，以不太大的降溫速率就能使溶液以玻璃態(tài)固化。很多人認為快速冷凍有益于生物活性，因為快速冷凍可以減少緩沖液結(jié)晶引起的 pH 變化，減低蛋白質(zhì)局部高離子強度的接觸時間，減少變性可能發(fā)生的時間。但是很多證據(jù)表明凍融和冷凍干燥后，快速冷凍對蛋白的活性回收不利，并對貯藏期凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性也有影響 [37]。用磷酸緩沖液和甘露醇作為賦形劑體系，在 ~ 時，冷 凍速率對人生長激素的可溶性聚合物形成的影響檢測不到，可是對不溶性聚合物形成的影響是顯著的，冷凍速率越高聚合物越多。不溶性聚合物的形成被冷凍前的低 pH 加速。 凍干溶液的 pH 很重要，對脫氨的影響較大。選用不同的緩沖溶液對 pH 的要求也不一樣。當(dāng)選用磷酸鹽作為緩沖液時，在較低的 pH（ ）下，有較少的脫氨組分，但在此 pH 下較易產(chǎn)生聚集 [38]。人生長激素溶液劑型就是選用較低的 pH，添加非離子表面活性劑防止聚集。 6 人生長激素最常用的凍干保護劑是甘氨酸和甘露醇。兩種配方比很重要，根據(jù)劑量的不同兩種物質(zhì)加入的比例是不同 一樣的。甘露醇作為保護劑和甘氨酸一起起到穩(wěn)定凍干制劑的作用。為了保證重新溶解后人生長激素的穩(wěn)定，也有在溶解水中加入非離子表面活性劑來增加溶液的物理穩(wěn)定性，如諾和諾德的 NorditropinSimpleXx，在溶解水中加入泊洛沙姆 188 以增加物理穩(wěn)定性。表 2 列出了價格典型的商品化重組人生長激素的配方。 表 2 常見商品化重組人生長激素的凍干配方 * 商品名 劑型 規(guī)格 賦形劑 緩沖鹽 rhGH 甘氨酸 甘露醇 蔗糖 NaH2PO4 Na2HPO4 pH Genotropin 凍干劑型 0 / / Humatrope 15 5 5 25 / 0 18 6 6 18 / 0 Nutropin 15 5 45 / Saizen 15 5 / / *來源于 FDA 網(wǎng)站相關(guān)產(chǎn)品的說明書 表 2 中可以看到大多數(shù)上市產(chǎn)品采用的甘氨酸和甘露醇配方系統(tǒng)。本文討論的產(chǎn)品就是采用冷凍干燥技術(shù)制備的凍干粉針劑型，也采用和上市產(chǎn)品同樣的甘氨酸和甘露醇體系，配方均得到批準，長期穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，凍干劑型和溶液劑型相比較在貨架期要穩(wěn)定的很多，這也是目前市場上還是主要以凍干劑型為主的原因。 場地變更的原因 注射用重組人生長激素是上海聯(lián)合賽 生物工程有限公司已上市十多年的老產(chǎn)品，隨著市場的擴大，原生產(chǎn)車間已不能滿足市場需求，為此在原址上新建了注射用重組人生長激素生產(chǎn)車間，用于 注射用重組人生長激素 的生產(chǎn)。由于在原址上新建，原質(zhì)量檢測、原輔材料采購和儲存，以及質(zhì)量保證系統(tǒng)均采用原來的系統(tǒng)，檢測、原輔材料和質(zhì)量保證系統(tǒng)的風(fēng)險較低。 本次是在原廠址增建了一個注射用重組人生長激素的生產(chǎn)線，包括了原液生產(chǎn)車間和制劑生產(chǎn)車間，對于本次新建車間經(jīng)歷了下面幾個階段。 表 3 新