【文章內(nèi)容簡介】 utualism)來描述宿主和腸道微生物之間共生關(guān)系 , 這反映出人類在這方面認識不足 , 尚未意識到宿主與腸道微生物之間的密切關(guān)系 , 以及腸道微生物對維持人類健康和正常菌落穩(wěn)定的巨大貢獻 [5052]。 到目前為止，人們已經(jīng)認識到只要胃腸道內(nèi)微生物菌群處于健康的平衡狀態(tài)，人類機體的健康就能夠得到保障。而一旦這些腸道內(nèi)的微生物平衡遭 到破壞就可能導致人體發(fā)生疾病，甚至危及生命[29,31]。 近年來國外學者大量研究和報道了 CGMP 的相關(guān)生理功能（如：雙歧桿菌增殖因子、抑制胃酸分泌、抑制病原體包括病毒和細菌等粘附至細胞、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)應答等），其生物學功能已經(jīng)等到了科學家和相關(guān)企業(yè)的關(guān)注，將在生物醫(yī)藥、功能食品以及專用食品的研究開發(fā)中為人類健康做出貢獻。但是國內(nèi)外有關(guān)CGMP 對 腸粘膜內(nèi)各類微生物區(qū)系的變化以及對 腸道中微生物菌群的調(diào)理作用方面的研究報道卻很少。因此我們需要對其調(diào)理腸道微生物的具體功能和機制作進一步的探討。 課題研究的意 義 腸道菌群與人體外部環(huán)境保持著一個平衡狀態(tài)，對人體的健康起著重要作用，但是這種平衡在某些情況下被打破，形成腸道菌群失調(diào)，從而引起多種疾病，如：炎性腸病（ IBD）、結(jié)腸癌、類風濕性關(guān)節(jié)炎、遺傳過敏性皮炎、哮喘等。近年來，隨著科技的進步人們逐漸認識到腸道微生物對人類健康的重要性。 研究腸道中的基本微生態(tài)規(guī)律對糾正菌群失調(diào)、增強體質(zhì)、提高健康水平、發(fā)展相應的微生態(tài)制劑具有重要的理論價值和實踐意義。 近年來 許多研究 報道顯示 CGMP有多種特殊的生物學活性 ，尤其是 CGMP能夠促進腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌的增 殖 ，但 國內(nèi)外關(guān) 于 CGMP對小鼠腸道菌群影響的 體內(nèi)試驗 研究報道卻很少。 綜上所述，酪蛋白糖巨肽在抗菌、調(diào)節(jié)腸道免疫、促進腸道益生菌的增殖等多方面都具有獨特的生物學功能，作為功能性食品方面又很好的潛力。 該研究對乳中功能性成分在維持其微生態(tài)平衡，探討腸道中微生物菌群與人類健康的關(guān)系以及調(diào)理腸道中微生物菌群的平衡等方面將提供一定的理論依據(jù)，并為其在功能性食品、醫(yī)藥或其它領(lǐng)域的應用方面奠定堅實的理論基礎。 課題研究內(nèi)容 本課題主要研究以下幾項內(nèi)容： 技術(shù)試驗條件的優(yōu)化 CGMP前后小鼠腸道菌群的變化； ERICPCR指紋圖譜技術(shù) 檢測灌胃 CGMP前后小鼠腸道菌群 群落結(jié)構(gòu) 的變化。 第二章 材料與方法 熒光原位雜交技術(shù)（ FISH）分析 CGMP 對小鼠腸道菌群的影響 實驗原料 CGMP 購自新西蘭 Tatua Dairy Cooperative 公司 主要化學 試劑 倒置 熒光顯微鏡（ Nikon，日本）；雜交緩沖液（ ， 20mMTrisHcl，pH=， %SDS， 30%（ V/V）的甲酰胺， 10%（ w/v）的硫酸葡聚糖）；漂洗緩 沖 液 （ ， 20mMTrisHcl ， pH= ）； PBS （ 130mMNacl ， ， pH=）；熒光探針（ 其中 EUB 338探針 3′末端標記 FITC 熒光染料 ， Enter143 Bif16 ENF 19 Lacb722 探針 3′末端標記 ROX 熒光染料 ， Invitrogen，美國）；多聚賴氨酸防脫玻片、 RNasefree蓋玻片 (博士德生物工程有限公司 ) 表 21 16S rRNA探針序列 Table 21 16S rRNAtargeted oligonucleotide probes Probe OPDcode Probe sequence（ 5′to3′） Target anism Reference EUB 338 SDBact0338aA18 GCTGCCTCCCGTAGGAGT All Bacteria [23] Enter1432 SGEnter1432aA15 GTTTTGCAACCCACT Enterobacteriaceae [24] Bif164 SGBif0164bA18 CATCCGGYATTACCACCC Bifidobacterium [25] Lacb722 SGLacto722aA25 YCACCGCTACACATGRAGTTCCACT Lactobacillus group [26] ENF 191 SGENF191aA13 GAAAGCGCCTTTCACTCTTATGC Enterococcus faecalis [27] 注： R=G/A, Y=T/C, M=A/C, K= G/T, S= G/C, W= A/T, H=A/C/T, B=G/T/C, V=G/C/A, D=G/A/T, N=G/A/T/C. 試驗動物及分組： 實驗動物： 25～ 30g 健康的 BALB/c 雄性小鼠， 購自中國人民 解放軍 軍事醫(yī)學科學 實驗動物中心 ，合格證號為： 0038134。將實驗動物適應飼養(yǎng)一周后隨機分成 2組。其中對照組每天 早上 灌胃 ， CGMP組每天 早上 灌胃 濃度為 ， 灌胃周期為 2周。 表 22 實驗動物的分組設 置 組別 試驗項目 對照組 生理鹽水 劑量組 試驗 儀器： 表 23 實驗儀器 設備清單 儀器名稱與型號 生產(chǎn)廠家 三洋全自動滅菌鍋 日本三洋公司 DS5MC 倒置熒光顯微鏡 日本尼康公司 新飛 BCD2080 冰箱 新飛電器有限公司 高速冷凍離心機 美國 Sigma 公司 微濾裝置 PallGelman Laboratory 超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司 核酸電泳儀 北京六一 PCR 儀 pH 酸度計 雷磁 SHP205B 生化培養(yǎng)箱 天津天宇實驗儀器有限公司 國華 250 生化培養(yǎng)箱 深圳天南海北公司 MGC250 光照培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司 微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司 JA4103 電子天平 上海精天電子儀器有限公司 HHS112 電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠 微量進樣器 芬蘭 Biohit 公司 Olympus CX31 可拍照顯微鏡 日本 OLYMPUS 公司 試驗方法 FISH 試驗 雜交 條件的優(yōu)化 本 試驗 以 EUB338 探針為例 針對雜交溫度、探針濃度以及溶菌酶的濃度設計了 3 因素 3水平正交試驗以及 擬水平法正交試驗設計 以求得雜交的最佳條件。 表 24 因素 水平 1 2 3 雜交溫度 A(℃ ) 46 48 50 探針濃度 B( ng/ul ) 5 10 20 溶菌酶濃度 C( mg/ ml ) 10 30 50 表 25 擬水平法正交試驗設計 因素 水平 1 2 3 雜交溫度 A(℃ ) 48 50 48 探針濃度 B( ng/ul ) 20 25 30 溶菌酶濃度 C( mg/ ml ) 1 5 10 FISH 技術(shù) 分析 CGMP 對小鼠腸道菌群的影響 [28] （ 1） 糞便樣品采集及前處理： 分別在試驗的第 0、 15 天 采集 兩組 小鼠新鮮糞便置于密封的無菌厭氧帶袋 ， 存于冰盒中，并盡可能早地進行處理。 將無菌采集的糞便樣品 置于 5mL 離心管 (RNasefree)中， 然后加入 于 PBS（ 大小的膜過濾）中，充分震蕩混勻。然后將上述糞便樣品 4℃ 下 700g 離心 2min 以除去糞便中的殘渣部分 。 （ 2） 固定： 取 1ml上述 離心上清液置于 3ml新鮮配置的 4%的 PFA液（多聚甲醛溶于 PBS， 的膜過濾處理）， 4℃ 固定約 16h（如果不及時進行雜交的話 20℃ 保存在50%（ v/v）的乙醇 PBS 中）。 （ 3） 玻片制備： 向 固定好的菌液 中加入 10ul 濃度為 10mg/ml 溶菌酶（溶菌酶溶于100mMTrisHcl 液 ,PH=） 37℃下孵育 20min。取 10ul 上述固定液 均勻涂抹于干凈的用多聚賴氨酸處理過的載玻片上（可根據(jù)靶細菌的數(shù)量不同用 PBS 來進行適當?shù)倪M行稀釋 ，其中檢測雙歧桿菌時菌液稀釋 107倍，檢測乳酸桿菌時菌液 稀釋 108倍，檢測腸桿菌時菌液稀釋 103倍，檢測腸球菌時菌液稀釋 102倍 ）。然后用乙醇梯度（ 50%， 75%， 95%）對細菌進行脫水各 2min，室溫干燥。 （ 4） 雜交以及雜交后處理： 將雜交緩沖液（探針 終 濃度為 20 ng/ul）均勻加到載玻片表面，覆蓋蓋玻片 （ RNasefree）， 48℃ 濕盒中雜交過夜約 16h。用漂洗緩沖液 48℃ 浸泡 30min（洗去未雜交上的探針），然后用雙蒸水快速漂凈，干燥，立即進行熒光顯微檢測。 （ 5） 計數(shù)： 隨機抽取 15 個視野，采用 DS5MC 熒光顯微系統(tǒng)和 NISElements BR 成像分析系統(tǒng)進行細菌熒光顯影計數(shù)。 CGMP 對小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的分析 主要化學試劑 PCR 反應所需的 Buffer、 Taq DNA 聚合酶、 dNTP 等購自 TakaRa 公司 , 所需ERIC 引物（ ERIC1： 5,ATGTAAGCTCCTGGGGAATCAC3, ERIC2： 5,AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG3， ） 由上海生工公司合成 。 試驗動物及分組： 實驗動物： 25～ 30g 健康的 BALB/c 雄性小鼠， 購自中國人民 解放軍 軍事醫(yī)學科學 實 驗動物中心 ，合格證號為： 0038134。將實驗動物適應飼養(yǎng)一周后隨機分成 2 組。其中對照組每天灌胃 生理鹽水， CGMP 組每天灌胃 濃度為 ， 灌胃周期為 2周。 ERICPCR 反應條件的優(yōu)化 在文獻報道的基礎上，本試驗針對腸道微生物總 DNA 進行 ERICPCR 擴增體系（ Mg2+ 、 Taq 酶、引物量）進行了一定的優(yōu)化。 ERICPCR 擴 增 程 序： 94 ℃ 預 變 性 5 min； 94℃ 變性 50 s， 48℃ 退火 90 S， 72℃ 延伸 3 min， 35 個循環(huán)； 72℃ 最后延伸 9 min； ERICPCR 反應中 Mg2+濃度優(yōu)化 如表 26 所示，在 50ulPCR 反應 體系中 Mg2+濃度 梯度 分別設為 ： 、2mM 、 、 3mM。其中 A、 B、 C、 D分別是 四 個不同的基因組 DNA 模板。 表 26 Mg2+濃度 編號 A B C D A1 B1 C1 D1 2mM A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D3 3mM A4 B4 C4 D4 ERICPCR 反應 體系 中 Taq 酶濃度優(yōu)化 如表 27所示，在 50 μLPCR 體系中 Taq 酶濃度分別設為： 、 、 、 5U。其中 A、 B、 C、 D分別是 四 個不同的基因組 DNA 模板。 表 27 Taq 酶濃度 編號 A B C D A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D3 5U A4 B4 C4 D4 ERICPCR 反應 體系 中引物濃度優(yōu)化 如表 28 所示，在 50 μ LPCR 體系中引物濃度分別設為： 、 、 、 。其中 A、 B、 C、 D分別是 四 個不同的基因組 DNA 模板。 表 28 引物濃度 編號 A B C D A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D3 A4 B4 C4 D4 試驗方法 ： 采樣 分別在試驗的第 0、 1 21 天 （即停止灌胃后一周） 采集 兩組 小鼠新鮮糞便置于密封的無菌厭氧帶袋， 存 于冰盒中，并盡可能早地進行處理。 樣品的前處理 取 200mg 糞便樣品置于 2ml 離心管中，加入 1mlPBS (pH )，充分均質(zhì)化后 200g 離心 6min，取上清。向沉淀中再加入 1mlPBS (pH )， 200g 離心 6 分鐘，取上清，合并兩次上清再次離心， 300g 離心 6分鐘 , 收集上清， 20200g，8min 再次離心收集菌體，用 PBS將菌體洗滌兩次。 糞便微生物總 DNA 的提取 [29] 向上述所得菌體中加入 300ul 裂解液Ⅰ（ 150mM Nacl , 100mM , pH=）， 10%的溶菌酶 100ul， 1%的 RnaseA 40ul，混合均勻 37℃保溫 40min。然后加入 300ul 裂解液