【導(dǎo)讀】CN)上的一個(gè)多肽片段。κ-酪蛋白是酪蛋白的一種，它是酪蛋白中唯一一種含有。氨基酸組成分析表明，κ-酪蛋白含有169個(gè)氨基酸殘基，兩個(gè)胱氨酸殘。酸等，分子量約為×104[1]。κ-酪蛋白中有半乳糖、N一乙酰氨基半乳糖。、N一乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)三種糖。κ-酪蛋白產(chǎn)生的[2,3]。干酪加工時(shí)凝乳酶水解酪蛋白的苯丙。兩部分，此多肽含有較多的碳水化合物，稱之為―糖巨肽‖，酪蛋白來源的糖巨肽稱為―酪蛋白糖巨肽‖。牛的CGMP有A和B2種遺傳變異型,其不?；被岱謩e為Thr和Asp,而B型為Ile和Ala。此外,該多肽的131、133、在凝乳酶凝集乳酪制造過程產(chǎn)生的乳清中含有大量的CGMP,有。亂毒素與受體的結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞免受毒素的侵染。多項(xiàng)研究結(jié)果表明CGMP能夠有效阻止齲齒、病。被注射CGMP的老鼠也有同樣的反應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，胃蛋。抑制胃液的分泌高達(dá)50%，血清中的促胃泌激素也被抑制約8%。從而抑制脾臟淋巴。母體產(chǎn)道中的微生物在嬰兒早期的糞樣中不會(huì)富集，只在剛出生后

　　

【正文】 l cells hybridized with a Enterococcus oligonucleotide probe (ENC221FITC). (D): Bacterial cells hybridized with a Bi?dobacterium genusspeci?c oligonucleotide probe (Bif164FITC). (E): Bacterial cells hybridized with an Enterobacteriaceae oligonucleotide probe (Enter1432FITC). CGMP 對(duì)小鼠腸道乳酸桿菌 、雙歧桿菌 的影響 C D E 02468100 3 6 9 12 15試驗(yàn)天數(shù)乳酸桿菌占總菌數(shù)的百分比對(duì)照組CGMP組 圖 32 CGMP 對(duì)小鼠腸道乳酸桿菌的影響 024680 3 6 9 12 15試驗(yàn)天數(shù)雙歧桿菌占總菌的百分比對(duì)照組CGMP組 圖 33 CGMP 對(duì)小鼠腸道 雙歧桿菌 的影響 從表 35所示數(shù)據(jù)可以看出， 在實(shí)驗(yàn)的第 0 天， 對(duì)照組和 CGMP 組 小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量分別為： 177。 和 177。 （ log CFU/g 濕糞便 ） ；雙歧桿 菌的數(shù)量分別為： 177。 和 177。 （ log CFU/g 濕糞便 ） ， 兩組 水平 基本一致，不存在明顯的差異。 對(duì)照組 對(duì)小鼠灌胃生理鹽水后，其腸道內(nèi)乳酸桿菌 和雙歧桿菌 的量 均 沒有發(fā)生明顯的變化，說明生理鹽水以及灌胃的刺激對(duì)小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌 和雙歧桿菌 沒有 產(chǎn)生 明顯的影響。 對(duì)小鼠灌胃 CGMP 后 ，在不同的時(shí)間點(diǎn) 分別 用 Lacb722 探針 和 Bif164 探針 檢測 得 到的腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的 數(shù)量不斷上升 ， 灌胃 2 周后 其腸道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量 增加 到 了177。（ log CFU/g 濕糞便 ） ，與灌胃前的 177。（ log CFU/g 濕糞便 ） 相 比 ； 雙歧桿菌的數(shù)量 增加到了 177。 （ log CFU/g 濕糞便 ） ，與灌胃前的177。（ log CFU/g 濕糞便 ） 相比， 其數(shù)量 均 增加了一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。用 SPSS分別 對(duì) 得到的乳酸桿菌和雙歧桿菌的 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果得出 二者的 P 值均小于，充分說明灌胃 CGMP 后小鼠腸道內(nèi)的乳酸桿菌 和雙歧桿菌的 數(shù)量 均 發(fā)生了顯著的變化 。 從 圖 3 33 可以看出， 在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)對(duì)照組和 CGMP 組腸道內(nèi)乳酸桿菌占總菌數(shù)的百分比分別為 （ 177。 ） %和（ 177。 ） %， 雙歧桿菌 占總菌數(shù)的百分比分別為 （ 177。 ） %和（ 177。 ） %， 這 兩組 數(shù)據(jù) 充分說明在未對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn)材料之前，各組小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌 和雙歧桿菌 所占 總菌數(shù)的 比例基本 處于同一水平， 兩組小鼠 沒有 存在 明顯的 差異 。 對(duì)照組小鼠灌胃了 的生理鹽水后，腸道中乳酸桿菌 和雙歧桿菌 占總菌數(shù)的百分比 沒有發(fā)生明顯的變化，只是在一定范圍內(nèi)波動(dòng)。而對(duì)小鼠灌胃 CGMP 后 ，在灌胃的前期，乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖作用并不明顯， 小鼠腸道內(nèi) 乳酸桿菌 和雙歧桿菌 所占比例 均 從第 4天開始發(fā)生了明顯的變化 ，呈不斷上升的趨勢 。 在灌胃 CGMP 兩周后，小鼠腸道內(nèi)的乳酸桿菌 所占比例 達(dá)到了（ 177。 ） %， 比灌胃前的平均水平增長了 407%；雙歧桿菌所占比例 達(dá)到了（ 177。 ） %，兩組 數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 分析 ， 結(jié)果得出二者的 P 值均小于 ， 充分說明 對(duì)小鼠灌胃 CGMP 后 可以明顯促進(jìn)腸道內(nèi)乳酸桿菌 和雙歧桿菌 的增殖 。 CGMP 對(duì)小鼠腸道 腸桿菌的影響 01234560 3 6 9 12 15試驗(yàn)天數(shù)腸桿菌占總菌的百分比對(duì)照組CGMP組 圖 34 CGMP 對(duì)小鼠腸道 腸桿菌 的影響 從表 35所示數(shù)據(jù)可以看出，在實(shí)驗(yàn)的第 0 天，對(duì)照組和 CGMP 組小鼠腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)量分別為： 177。 和 177。 （ log CFU/g 濕糞便 ） ，兩組小鼠腸桿菌的數(shù)量較接近，沒有明顯的差異。對(duì)照組在灌胃生理鹽水期間，小鼠腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)緩緩的波動(dòng)趨勢，沒有發(fā)生大的變化，說明生理鹽水對(duì)小鼠腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)量沒有明顯的影響。而 CGMP 組在灌胃期間，小鼠腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，灌胃 2周后其數(shù)量降低到了 177。1. 21（ log CFU/g 濕糞便 ） ，數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 分析得 出 P值小于 ，充分說明對(duì)小鼠灌胃 CGMP 后其腸道內(nèi)腸桿菌的數(shù)量與灌胃前相比存在顯著性差異 ，即可說明 CGMP能夠有效地抑制 小鼠腸道內(nèi)腸桿菌的增殖。 從圖 34 可以看出，在對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃前 對(duì)照組中腸桿菌占腸道總菌的（ 177。 ） %， CGMP 組在灌胃之前 腸桿菌占腸道總菌的（ 177。 ） %，兩組數(shù)據(jù)相比不存在顯著性差異。但 在 灌胃期間，兩組小鼠腸道內(nèi)腸桿菌的變化趨勢 卻不同。對(duì)照組小鼠腸道內(nèi)腸桿菌 總菌的 比例在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，沒有明顯的規(guī)律，但 CGMP 組 小鼠腸道內(nèi)腸桿菌 總菌的 比例卻呈現(xiàn)出了逐漸下降的趨勢，在對(duì)小鼠 灌胃 CGMP 兩周后，小鼠腸道內(nèi)的腸桿菌降到了 （ 177。 ） %，下降了 %，數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 分析得 P 值 ， 進(jìn)一步 說明 了 CGMP 可以明顯 抑制 腸道內(nèi) 腸 桿菌的增殖 。 CGMP 對(duì)小鼠腸道腸球菌的影響 01234560 3 6 9 12 15試驗(yàn)天數(shù)腸球菌占總菌的百分比對(duì)照組CGMP組 圖 35 CGMP 對(duì)小鼠腸道 腸球菌 的影響 從表 35所示數(shù)據(jù)可以看出，在實(shí)驗(yàn)的第 0天，對(duì)照組和 CGMP 組小鼠腸道內(nèi)腸 球 菌的數(shù)量分別為： 177。 和 177。 （ log CFU/g 濕糞便 ） ，兩組小鼠腸 球 菌的數(shù)量較接近，沒有明顯的差異。對(duì)照組 和 CGMP 組 在灌胃期間， 兩組 小鼠腸道內(nèi)腸 球 菌的數(shù)量呈現(xiàn)緩緩的 上下 波動(dòng)趨勢，沒有發(fā)生大 的變化，說明生理鹽水 和 CGMP 對(duì)小鼠腸道內(nèi)腸 球 菌的數(shù)量沒有明顯的影響。 兩組 數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 分析得 出 P值 均大 于 ，充分說明對(duì)小鼠灌胃 CGMP 后其腸道內(nèi)腸 球 菌的數(shù)量與灌胃前相比 并不 存在顯著性差異 。 在對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃前 對(duì)照組 和 CGMP 組 中腸 球 菌占腸道總菌的 比例分別為：（ 177。 ） %和（ 177。 ） %兩組數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 分析得 P值大于 ，說明在試驗(yàn)灌胃前兩組小鼠腸道內(nèi)腸球菌的數(shù)量水平相當(dāng)，不存在顯著性差異。 在 灌胃期間，兩組小鼠腸道內(nèi)腸 球 菌的變化 幅度都不明顯。灌 胃前后的數(shù)據(jù) ，經(jīng)SPSS 分析得 對(duì)照組和 CGMP 組的 P 值 均 大于 ，說明 了 CGMP 對(duì)小鼠腸道內(nèi)腸球菌 沒有顯著得影響。 FISH 技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的比較 兩種方法所得到的數(shù)據(jù)如 所示， Lactobacillus4681012140 4 7 10 15 天數(shù)FISH Counts468101214Plate Countscounts detected by FISH (Log CFU/g)counts detected by culture method (Log CFU/g) Bifidobacteria4681012140 4 7 10 15 天數(shù)FISH Counts468101214Plate Countscounts detected by FISH (Log CFU/g)counts detected by culture method (Log CFU/g) Enterococcus4681012140 4 7 10 15天數(shù)FISH Counts468101214Plate Countscounts detected by FISH (Log CFU/g)counts detected by culture method (Log CFU/g) Enterobacteriaceae4681012140 4 7 10 15 天數(shù)FISH Counts468101214Plate Countscounts detected by FISH (Log CFU/g)counts detected by culture method(Log CFU/g) 圖 36 FISH 技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的比較 Fecal microbiota counts (log CFU/g feces) of Lactobacillus, Bi?dobacteria, Enterococcus spp and Enterobacteriaceae before and after 4, 7,10, 15 days of assumption of CGMP detected by culture method and FISH techniques. 傳統(tǒng)培養(yǎng)法與 FISH技術(shù)得到的微生物菌落數(shù)變化趨勢是一致的，但是 FISH技術(shù)檢測得到的數(shù)據(jù)要明顯地高于傳統(tǒng)法。培養(yǎng)法的不精確性主要有由以下幾方面原因：很多細(xì)菌的生長需要的未知性與不可培養(yǎng)性 , 各種細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基不同的選擇性 , 體外培養(yǎng)過程對(duì)微生物的應(yīng)激性 , 嚴(yán)格厭氧技術(shù)的困難性 , 選擇性 培養(yǎng)基的主觀選擇性， 微生物之間以及與宿主細(xì)胞間相互作用的復(fù)雜性等。熒光原位雜交技術(shù)不依賴于培養(yǎng)技術(shù)，可培養(yǎng)與不可培養(yǎng)的微生物均能夠檢測到， Sghir等 [24]早在 2020 年就報(bào)道設(shè)計(jì)合理的熒光原位雜交探針能夠檢測到糞便中接近90%的微生物。 因此 FISH 技術(shù) 具有更高的精確性和可信度。但是 FISH 技術(shù)不能得到微生物形態(tài)生化等方面的信息，因此在進(jìn)行微生物群落研究時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)的培養(yǎng)、 鏡檢等方法及現(xiàn)代分子生物學(xué)的多種方法，可為環(huán)境微生物群落研究提供更多的信息。 ERICPCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化 為了確定 ERICPCR的最佳試驗(yàn)條件，本研究在大量文獻(xiàn) 報(bào)道 的基礎(chǔ)上， 分別擬定 了 4個(gè) Mg2+濃度梯度（ 、 2mM 、 、 3mM）， 4 個(gè) Taq 酶濃度 梯度（ 、 、 、 5U）， 4個(gè)引物濃度 梯度 （ 、 、 、 ） ， 設(shè)計(jì)了 4個(gè)不同糞便樣品的平行試驗(yàn)， 其中每個(gè)樣品的 ERICPCR 均 重復(fù)了三次，所得圖譜顯示較好的重復(fù)性 ，所得圖譜 結(jié)果如下 圖 3 3 39所示。 Mg2+濃度對(duì) ERICPCR 反應(yīng)的影響 圖 37 Mg2+濃度對(duì) ERICPCR 反應(yīng)的影響 *其中 A B C D分別代表 4個(gè)不同的 糞便樣品 ； 1 2 3 4分別代表 、 2mM 、 、3mM這 4個(gè)水平 從電泳圖譜 37 中 可以看出， 個(gè)體 A 當(dāng) Mg2+濃度 梯度為 時(shí)，所得到的 ERICPCR 圖譜效果最差，小片段沒有擴(kuò)增出來 。 當(dāng)濃度梯度為 2mM 、 、3mM 時(shí)擴(kuò)增效果相差不大，但濃度梯度為 2mM 時(shí)，小片段的擴(kuò)增結(jié)果沒有 A3 和A4 的擴(kuò)增效果好，清晰度不夠。因此，綜合 上述試驗(yàn)結(jié)果，個(gè)體 A 的 PCR 擴(kuò)增體系中 Mg2+最適濃度為 和 3mM。 個(gè)體 B 當(dāng) Mg2+濃度 梯度為 時(shí)，所得到的 ERICPCR 圖譜效果最差，得到的圖譜豐度較差。 當(dāng)濃度梯度為 2mM 、 時(shí)擴(kuò)增效果相差不大， 且效果最好， Mg2+濃度 梯度為 3mM 時(shí)，有個(gè)別片段沒有擴(kuò)增，且 清晰度不夠。因此，綜合 考慮 ，個(gè)體 B的 PCR 擴(kuò)增體系中 Mg2+最適濃度為 2mM 和 。 個(gè)體 D 當(dāng) Mg2+濃度 梯度為 mM、 2mM 時(shí)，所得到的 ERICPCR 圖譜效果較 差， 尤其是小片段的擴(kuò)增效果很不理想。 當(dāng)濃度梯度為 和 3mM 時(shí) 擴(kuò)增效果相差不大， 且效果較好。 因此，綜合上述試驗(yàn)結(jié)果 ，個(gè)體 D 的 PCR 擴(kuò)增體系中 Mg2+最適濃度為 和 3mM。 綜上所述， 當(dāng) PCR 反應(yīng)體系中 Mg2+濃度為 和 3mM 時(shí)圖譜條帶豐度較大 、圖譜較清晰， 且 擴(kuò)增 效果相當(dāng)，所以確定 PCR 體系中 Mg2+最適濃度為 。 Taq 酶濃度對(duì) ERICPCR 反應(yīng)的影響 圖 38 Taq 酶濃度對(duì) ERICPCR 反應(yīng)的影響 *其中 A B C D分別代表 4個(gè)不同的 糞便樣品 ； 1 2 3 4分別代表 、 、 、5U這 4個(gè)水平 從 4 個(gè)糞便樣品的 電泳圖譜 38 可以看出， Taq 酶濃度過較小時(shí)， PCR 效果最差 ，圖譜條帶豐度較小， 大部分片段集中在 400bp900bp 之間， 只能擴(kuò)增出腸道中的 優(yōu)勢 菌群 ； 當(dāng) PCR 反應(yīng)體系中 Taq 酶濃度 梯度 為 、 5U時(shí) ，圖譜條帶豐度較大， 條帶清晰，擴(kuò)增 效果 較為 理想， 且 三個(gè)濃度梯度下的ERICPCR 圖譜效果相當(dāng)。充分說明，當(dāng) Taq 酶濃度 梯度為 時(shí)， PCR 體系中的 Taq 酶 已經(jīng)達(dá)到了飽和濃度，當(dāng)再增加其濃度時(shí) PCR 圖譜 的 效果 沒有進(jìn)一步提高。 綜上所述， 當(dāng) PCR 反應(yīng)體系中