【正文】 UB338 探針為例 ，在文獻(xiàn)參考的基礎(chǔ)上 針對(duì)雜交 條件包括： 溫度、探針濃度以及溶菌酶的濃度設(shè)計(jì)了 3因素 3水平正交試驗(yàn)以及 擬水平法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以求得 熒光原位 雜交 試驗(yàn) 的最佳 雜交 條件。 ( 1010) 177。 ( 1011) 177。s,n = 6) 探針 150g,2min 300g,2min 600g,2min 800g,2min EUB338 __ 177。 表 31 樣本離心速度對(duì)靶細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響 (x 177。 而離心速度過低時(shí)，菌懸液中會(huì)有大量的雜質(zhì)殘留，會(huì)加大玻片制備的難度，且玻片上得雜質(zhì)嚴(yán)重影響計(jì)數(shù)得準(zhǔn)確性。 第三章 結(jié)果與分析 樣品離心速度對(duì)把細(xì)菌計(jì)數(shù)的影響 本研究 以 EUB338和 Bif164探針為例 分別采用冷凍低速和冷凍高速對(duì)樣品進(jìn)行離心， 所得結(jié)果如表 2 所示。應(yīng)用SPSS 軟件對(duì)兩組小鼠腸道菌群的生物多樣性指數(shù)進(jìn)行 Oneway AN0VA 分析。 圖譜數(shù)據(jù)分析 通過 Quantity One 軟件，將 ERICPCR 圖譜轉(zhuǎn)變?yōu)椴ǚ鍒D， 每個(gè)波峰代表一個(gè) ERIC 條帶， 峰下面積代表該條帶亮度即該類群的種群數(shù)量。擴(kuò)增程序： 94℃預(yù)變性 5 min； 94℃變性 50s， 48℃退火 90S， 72℃延伸 3min，35 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 9min。 DNA 質(zhì)量檢測 糞便微生物總 DNA經(jīng) %（ W/V） 瓊脂糖凝膠電泳 ， Goldview染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測分析。 20200g 離心 15min， 70%的乙醇洗滌一次，然后 20200g 離心 5min。加入等體積的 Tris飽和酚：氯仿：異戊醇（ 25： 24： 1），充分混合后 20200g 離心 8min，取上清；再加入等體積的氯仿：異戊醇（ 24： 1）， 20200g 離心 8min，取上清（重復(fù)抽提操作一次）。 糞便微生物總 DNA 的提取 [29] 向上述所得菌體中加入 300ul 裂解液Ⅰ（ 150mM Nacl , 100mM , pH=）， 10%的溶菌酶 100ul， 1%的 RnaseA 40ul，混合均勻 37℃保溫 40min。 樣品的前處理 取 200mg 糞便樣品置于 2ml 離心管中，加入 1mlPBS (pH )，充分均質(zhì)化后 200g 離心 6min，取上清。其中 A、 B、 C、 D分別是 四 個(gè)不同的基因組 DNA 模板。其中 A、 B、 C、 D分別是 四 個(gè)不同的基因組 DNA 模板。其中 A、 B、 C、 D分別是 四 個(gè)不同的基因組 DNA 模板。 ERICPCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化 在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)針對(duì)腸道微生物總 DNA 進(jìn)行 ERICPCR 擴(kuò)增體系（ Mg2+ 、 Taq 酶、引物量）進(jìn)行了一定的優(yōu)化。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分成 2 組。 CGMP 對(duì)小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的分析 主要化學(xué)試劑 PCR 反應(yīng)所需的 Buffer、 Taq DNA 聚合酶、 dNTP 等購自 TakaRa 公司 , 所需ERIC 引物（ ERIC1： 5,ATGTAAGCTCCTGGGGAATCAC3, ERIC2： 5,AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG3， ） 由上海生工公司合成 。用漂洗緩沖液 48℃ 浸泡 30min（洗去未雜交上的探針），然后用雙蒸水快速漂凈，干燥，立即進(jìn)行熒光顯微檢測。然后用乙醇梯度（ 50%， 75%， 95%）對(duì)細(xì)菌進(jìn)行脫水各 2min，室溫干燥。 （ 3） 玻片制備： 向 固定好的菌液 中加入 10ul 濃度為 10mg/ml 溶菌酶（溶菌酶溶于100mMTrisHcl 液 ,PH=） 37℃下孵育 20min。然后將上述糞便樣品 4℃ 下 700g 離心 2min 以除去糞便中的殘?jiān)糠?。 表 24 因素 水平 1 2 3 雜交溫度 A(℃ ) 46 48 50 探針濃度 B( ng/ul ) 5 10 20 溶菌酶濃度 C( mg/ ml ) 10 30 50 表 25 擬水平法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 因素 水平 1 2 3 雜交溫度 A(℃ ) 48 50 48 探針濃度 B( ng/ul ) 20 25 30 溶菌酶濃度 C( mg/ ml ) 1 5 10 FISH 技術(shù) 分析 CGMP 對(duì)小鼠腸道菌群的影響 [28] （ 1） 糞便樣品采集及前處理： 分別在試驗(yàn)的第 0、 15 天 采集 兩組 小鼠新鮮糞便置于密封的無菌厭氧帶袋 ， 存于冰盒中，并盡可能早地進(jìn)行處理。其中對(duì)照組每天 早上 灌胃 ， CGMP組每天 早上 灌胃 濃度為 ， 灌胃周期為 2周。 第二章 材料與方法 熒光原位雜交技術(shù)（ FISH）分析 CGMP 對(duì)小鼠腸道菌群的影響 實(shí)驗(yàn)原料 CGMP 購自新西蘭 Tatua Dairy Cooperative 公司 主要化學(xué) 試劑 倒置 熒光顯微鏡（ Nikon，日本）；雜交緩沖液（ ， 20mMTrisHcl，pH=， %SDS， 30%（ V/V）的甲酰胺， 10%（ w/v）的硫酸葡聚糖）；漂洗緩 沖 液 （ ， 20mMTrisHcl ， pH= ）； PBS （ 130mMNacl ， ， pH=）；熒光探針（ 其中 EUB 338探針 3′末端標(biāo)記 FITC 熒光染料 ， Enter143 Bif16 ENF 19 Lacb722 探針 3′末端標(biāo)記 ROX 熒光染料 ， Invitrogen，美國）；多聚賴氨酸防脫玻片、 RNasefree蓋玻片 (博士德生物工程有限公司 ) 表 21 16S rRNA探針序列 Table 21 16S rRNAtargeted oligonucleotide probes Probe OPDcode Probe sequence（ 5′to3′） Target anism Reference EUB 338 SDBact0338aA18 GCTGCCTCCCGTAGGAGT All Bacteria [23] Enter1432 SGEnter1432aA15 GTTTTGCAACCCACT Enterobacteriaceae [24] Bif164 SGBif0164bA18 CATCCGGYATTACCACCC Bifidobacterium [25] Lacb722 SGLacto722aA25 YCACCGCTACACATGRAGTTCCACT Lactobacillus group [26] ENF 191 SGENF191aA13 GAAAGCGCCTTTCACTCTTATGC Enterococcus faecalis [27] 注： R=G/A, Y=T/C, M=A/C, K= G/T, S= G/C, W= A/T, H=A/C/T, B=G/T/C, V=G/C/A, D=G/A/T, N=G/A/T/C. 試驗(yàn)動(dòng)物及分組： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 25～ 30g 健康的 BALB/c 雄性小鼠， 購自中國人民 解放軍 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 ，合格證號(hào)為： 0038134。 該研究對(duì)乳中功能性成分在維持其微生態(tài)平衡，探討腸道中微生物菌群與人類健康的關(guān)系以及調(diào)理腸道中微生物菌群的平衡等方面將提供一定的理論依據(jù)，并為其在功能性食品、醫(yī)藥或其它領(lǐng)域的應(yīng)用方面奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。 近年來 許多研究 報(bào)道顯示 CGMP有多種特殊的生物學(xué)活性 ，尤其是 CGMP能夠促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌的增 殖 ，但 國內(nèi)外關(guān) 于 CGMP對(duì)小鼠腸道菌群影響的 體內(nèi)試驗(yàn) 研究報(bào)道卻很少。近年來，隨著科技的進(jìn)步人們逐漸認(rèn)識(shí)到腸道微生物對(duì)人類健康的重要性。因此我們需要對(duì)其調(diào)理腸道微生物的具體功能和機(jī)制作進(jìn)一步的探討。 近年來國外學(xué)者大量研究和報(bào)道了 CGMP 的相關(guān)生理功能（如：雙歧桿菌增殖因子、抑制胃酸分泌、抑制病原體包括病毒和細(xì)菌等粘附至細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)應(yīng)答等），其生物學(xué)功能已經(jīng)等到了科學(xué)家和相關(guān)企業(yè)的關(guān)注，將在生物醫(yī)藥、功能食品以及專用食品的研究開發(fā)中為人類健康做出貢獻(xiàn)。 到目前為止，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到只要胃腸道內(nèi)微生物菌群處于健康的平衡狀態(tài)，人類機(jī)體的健康就能夠得到保障。像生理學(xué)家描述人體普通器官一樣，有學(xué)者[50]建議用 ―微生物器官 ‖(microbial an)來描述腸道微生物菌群：他由不同種類但彼此又相互聯(lián)系，并與宿主細(xì)胞之間不斷地進(jìn)行信息交 流的細(xì)胞構(gòu)成；他消耗、存儲(chǔ)和重新分布能量；他生理性地調(diào)控重要化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化；他通過自我復(fù)制來維持和修復(fù)自身。如何實(shí)現(xiàn)對(duì) 人與動(dòng)物胃腸道內(nèi)微生物菌群的平衡以及相關(guān)的基礎(chǔ)理論問題的研究是當(dāng)今科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)問題。靳連群 [48]等應(yīng)用基因芯片對(duì)涉及 9 個(gè)菌屬的 143 株腸道致病菌在相同的條件下進(jìn)行了雜交檢測，得到菌屬 (科 )特異性的雜交圖譜，從而達(dá)到對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測鑒定的目的。 該微陣列與標(biāo)記的核酸樣品雜交后 , 能快速、 準(zhǔn)確、 大 規(guī)模地獲取樣品核酸序列信息。 大量的研究表明以 ERICPCR指紋圖譜技術(shù)為基礎(chǔ)的一系列分子生物學(xué)方法是研究復(fù)雜環(huán)境微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的一種有效方法。 魯海峰 [47]等采用 ERICPCR和 Southern雜交方法分析大熊貓腸道菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示大熊貓不同個(gè)體之間腸道微生物群落結(jié)構(gòu)比較相似，不同個(gè)體在不同時(shí)期表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性，但是當(dāng)個(gè)體出現(xiàn)健 康問題時(shí)腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定的波動(dòng)。 1999年， DiGiovanni 等 [21] 首次將ERICPCR技術(shù) 用于混合菌群 的分析中。 ERICPCR 實(shí)際上是一種長引物的隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù) (Long Primer RAPD, LPRAPD)技術(shù)。該序列長約 124～ 127 bp，并且在其中心存在高度保守長約 40 bp的核心序列 ERICPCR技術(shù)是利用 ERIC核心的高度保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR，因此通過該技術(shù)擴(kuò)增基因組 DNA，構(gòu)建 DNA指紋圖譜，建立快速檢測的分子分 型平臺(tái)，能廣泛用于微生物分類鑒定、環(huán)境微生物動(dòng)態(tài)分析等方面的研究 [46]。 RFLP 作為檢測細(xì)菌種內(nèi)或種間水平的方法，近年來被應(yīng)用于細(xì)菌，尤其是雙歧桿菌的分類及鑒定中。由某一限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的片段大小和數(shù)目在不同個(gè)體中即表現(xiàn)出差異。 A Fite[44]等應(yīng)用熒光定量 PCR 技術(shù)對(duì)腸道中的脫硫弧菌進(jìn)行定量分析，并且闡明了此技術(shù)能夠?qū)θ梭w腸道等復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境進(jìn)行準(zhǔn)確地分析。目前技術(shù) 作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法已被廣泛地應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究中。這些不足可以通 過其他生物學(xué)技術(shù)來彌補(bǔ)，因此， PCR DGGE 技術(shù)與其他生物技術(shù)相結(jié)合，將能更實(shí)際地反映微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能和動(dòng)態(tài)變化，提供微生物的空間分布、群落演替、原位生理等信息，促進(jìn)人們對(duì)微生物生態(tài)的認(rèn)識(shí)，為微生物資源的開發(fā)利用提供理性指導(dǎo)。R. Bibiloni[40]等應(yīng)用 PCRDGGE 技術(shù)對(duì)結(jié)腸炎小鼠的大腸微生物區(qū)系進(jìn)行了分析，證實(shí)了 PCRDGGE 可以有效地檢測腸道中微生物組成的變化。 PCR DGGE 技術(shù)可以用來分析為生物多樣性，監(jiān)測為生物群落動(dòng)態(tài)性等。分子的形狀主要是由其一級(jí)結(jié)構(gòu)（即序列組成）決定的，堿基之間的氫鍵是維持二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，這種作用力對(duì)溫度或化學(xué)變性劑敏感，當(dāng)溫度或化學(xué)變性劑升高到一定值，就會(huì)破壞氫鍵，使 DNA 雙鏈部分打開。 DGGE/TGGE 技術(shù) DGGE/TGGE 電泳技術(shù) 能夠分離長度相同但序列有異的核酸分子混合物。近幾年來人們已經(jīng)證實(shí)將熒光原位雜交技術(shù)與流式細(xì)胞儀結(jié)合起來是一項(xiàng)很有用的技術(shù)。 近年來，國外很多研究人員已經(jīng)將熒光原位雜交技術(shù)成功地應(yīng)用于研究復(fù)雜的腸道微生物系統(tǒng)中 [1214]。因此根據(jù)待測微生物 16S rRNA片段中的保守序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的寡核苷酸探針就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶微生物的檢測。 熒 光原位雜交方法不僅能夠鑒定自然生態(tài)系統(tǒng)中的不同菌群 , 了解菌群結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并且確定它們的定殖位點(diǎn)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行準(zhǔn)確的定量研究。 1988年 , Giovannoni 等 [11]首次將熒光原位雜交技術(shù)（ fluorescence in situ hybridization， FISH)引入細(xì)菌學(xué)研究中 , 使用放射性標(biāo)記 rRNA 寡核苷酸探針檢測微生物。 Leblond 等 [37]對(duì) 4 種 5 株雙歧桿菌的 16SrRNA 序列進(jìn)行了測定，并同 GenBank/EMBL 中的其他雙歧桿菌 16SrRNA 序列比較構(gòu)建了發(fā)生樹，表明 16SrRNA 序列也可以區(qū)別不同種的雙歧桿菌。 目前大多數(shù) 微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)都是依賴于 16S rRNA 基因序列 的 高度保守 性， 其核苷酸位點(diǎn)的變化具有種的特異性。 微生物生態(tài)學(xué)主要以微生物基因組 DNA的序列信息為依據(jù)，通過分析樣品中 DNA分子的種類和數(shù)量來反映微生物之間以及微生物與其周圍環(huán)境條件相互作用關(guān)系的科學(xué) [9]。 表 11 傳統(tǒng)培養(yǎng)微生物方法的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 廉價(jià) 費(fèi)時(shí)費(fèi)力 應(yīng)用范圍廣 樣品要求立即處理 可以達(dá) 到細(xì)菌數(shù)目定量 嚴(yán)格厭氧菌要求專業(yè)的技術(shù)和設(shè)備 由專業(yè)的微生物學(xué)家操作，可以得到復(fù)雜的生態(tài)學(xué)的表征 一旦培養(yǎng)的細(xì)菌分離出來后，需要很多技術(shù)進(jìn)行鑒定 可以進(jìn)行生理學(xué)研究 選擇性培養(yǎng)基