【文章內(nèi)容簡介】 而影響多糖提取率的高低。為解決這個(gè)問題我們在提取過程中可采用正交實(shí)驗(yàn)方法通過排除或減少干擾因素，確定最佳提取方法，提高食用菌多糖的提取率。 多糖的抗氧化性 多糖抗氧化作用的機(jī)制 近幾年來，隨著自由基生物學(xué)與自由基醫(yī)學(xué)研究的迅速發(fā)展，現(xiàn)已證明多種疾病的發(fā)生和發(fā)展與自由基對組織細(xì)胞的損傷關(guān)系密切 [16]。如果自由基的產(chǎn)生和清除失衡，就會對機(jī)體造成損傷，導(dǎo)致疾病。 大量研究表明多糖具有抗氧化性，但是對于多糖抗氧化性的機(jī)理現(xiàn)在才剛剛起步，有些機(jī)理還不甚明確，人們認(rèn)為多糖的抗氧化性機(jī)理可能與以下幾種情況有關(guān)： （ 1）多糖分子間接作用與自由基本身。具體又可以分為兩種： ① 多糖直接作用于抗氧化酶。通過提高體內(nèi)原有抗氧化酶如： SOD， CAT， GSH2Px等的活性，間接發(fā)揮抗氧化作用。 ② 多糖分子絡(luò)合產(chǎn)生活性氧所必需的金屬離子。多糖結(jié)構(gòu)中的醇羥基可以與產(chǎn)生 ?OH 等自由基所必需的金屬離子（如 Fe2+， Cu2+等）絡(luò)合，使羥基自由基的產(chǎn)生受到抑制，進(jìn)而影響脂質(zhì)過氧化的啟動(dòng)，最終抑制活性氧的產(chǎn)生 [17]（ 2）多糖分子直接作用于自由基本身。對于脂質(zhì)過氧化而言，多糖分子可以直接捕獲脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生的活性氧，阻斷或減緩脂質(zhì)過氧化的進(jìn)行；對于 ?OH而言，多糖碳?xì)滏溕系臍湓涌梢耘c其結(jié)合成水，達(dá)到清除 ?OH的目的，而多糖的碳原子則因此成為碳自由基，并進(jìn)一步氧化形 成過氧自由基，最后分解成對機(jī)體無害的產(chǎn)物；對于超氧陰離子自由基而言，多糖可與其發(fā)生氧化反應(yīng)，達(dá)到清除的目的 [18]。 清除羥基自由基活性分析方法 目前國內(nèi)外對有關(guān) ?OH的分析測定方法有許多報(bào)道，關(guān)于 ?OH的分析一般是通過一定的體系產(chǎn)生 ?OH，再用一些方法來測定反應(yīng)產(chǎn)生的 ?OH，產(chǎn)生 ?OH的體系有 Fe3+—EDTA—抗壞血酸 —H2O2體系， Fe2+—EDTA—H2O2體系，抗壞血酸 —Cu2+—H2O2體系和黃嘌呤 —黃嘌呤氧化酶 —H2O2體系及紫外光照 H2O2光解產(chǎn)生 ?OH等 [18~23]。測定 ?OH 的方法主要有電子自旋共振法，高效液相色譜法，化學(xué)發(fā)光法，熒光分析法和分光光度法 [33]。電子自旋共振法和高效液相色譜法測定 ?OH，雖然靈敏度較高，但是所需儀器昂貴，操作也比較復(fù)雜，一般實(shí)驗(yàn)室難以應(yīng)用?；瘜W(xué)發(fā)光法操作簡便，不需要昂貴的儀器，測定快速。曾有人 [24]用化學(xué)發(fā)光法測定抗壞血酸 —Cu2+—H2O2體系產(chǎn)生的 ?OH。熒光分析法靈敏度同樣很高而且儀器也較化學(xué)發(fā)光法普及，徐向榮等 [25]采用 Ce3+熒光分析法測定 Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的 ?OH，該法簡便實(shí)用，測定快速。與以上方法相比應(yīng)用最廣泛最普及的還是 分光光度法，李平等 [26]利用分光光度法檢測各種自由基清除劑對Fe2+—EDTA—H2O2體系產(chǎn)生的 ?OH的清除作用。其原理是 Fenton 反應(yīng)是經(jīng)典的產(chǎn)生 ?OH的體系，可認(rèn)為能模擬人體內(nèi)產(chǎn)生 ?OH的過程，該反應(yīng)是以雙氧水為氧化劑，在亞鐵鹽作用下的氧化反應(yīng)： Fe2+ + H2O2 → Fe 3+ + ?OH + OH— 反應(yīng)產(chǎn)生的羥基可以氧化番紅使其褪色，利用分光光度法檢測吸光度變化間接測定所產(chǎn)生的羥自由基。在加入 H2O2前加入羥基自由基清除劑， Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基被清除或部分清除， 體系在 520nm 波長處的吸光度降低程度相應(yīng)減少，采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在 520nm 波長處測量被測物反應(yīng)液的吸光度并與空白液比較，從而測定被測物對 ?OH的清除作用。用番紅與羥自由基反應(yīng)的光度測定法，李平等利用分光光度法測定過山茱萸多糖清除羥自由基的能力，但是由于反應(yīng)體系中 H2O2含量過高，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差很大，為此我們通過試驗(yàn)對該方法進(jìn)行了改進(jìn)，確定了最佳反應(yīng)條件。 清除超氧陰離子自由基活性分析方法 對于超氧陰離子自由基（ O2?—）分析測定方法與 ?OH的分析方法相似，一般也是通過 產(chǎn)生超氧陰離子自由基（ O2?—）的體系產(chǎn)生 O2?—，然后再通過各種方法測定 O2?—， 產(chǎn)生超氧陰離子自由基（ O2?—）的體系有黃嘌呤 —黃嘌呤氧化酶—堿性 DMSO，甲硫酸非那宗 —NADPH[27， 28]和鄰苯三酚自氧化法 [29， 30]。測定 ?OH 的方法同樣適用于測定 O2?—，另外還有脈沖輻射法、比色法、單掃描極譜法 [31]、氧電極法 [32]等一些間接測定方法。由于實(shí)驗(yàn)方法需要儀器設(shè)備或條件特殊，一般難以滿足，所以測定 O2?—最常用的方法還是分光光度法。一般是利用分光光度法檢測鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物從而間接測定反應(yīng)產(chǎn)生的 O2?—，進(jìn)而研 究 O2?—清除劑的清除 O2?—能力。其反應(yīng)原理是：利用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)，測定加入自由基清除劑對產(chǎn)生的 O2?—清除作用。鄰苯三酚在弱堿性（ TrisHClEDTA 緩沖液 PH=⒏ 2）環(huán)境中自氧化分解產(chǎn)生 O2?—的反應(yīng) 鄰苯三酚 O2?— + 其他產(chǎn)物 隨著反應(yīng)的進(jìn)行， O2?—在體系中不斷積累，致使反應(yīng)液在 320nm， 325nm，440nm 波長的吸光度在反應(yīng)開始一段時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間變化而線性增長，通過測定鄰苯三酚自氧化系統(tǒng)的吸收光譜，確定自氧化速率最大值及最大吸收波長為325nm[29]，在此條件下，測定加入自由基清除劑反應(yīng)的吸收光譜確定自氧化速率，各系統(tǒng)的自氧化速率為 S，清除率為 E。另外人們模擬人體黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生 O2?—的原理研制出了抗超氧陰離子自由基試劑盒，應(yīng)用起來更方便。 2 實(shí)驗(yàn)部分 材料與試劑 香菇（新鮮市售），東北黑木耳（干，市售），裙帶菜（干，市售），真姬菇（市售），真姬菇純化多糖（ ZJ2），番紅為生化試劑，乙醇，丙酮，鄰苯三酚， L—抗壞血酸（ Vc），雙氧水，三羥甲基胺基甲烷，磷酸鹽， EDTANaFe（ Ⅱ ）等試劑均為國產(chǎn)分析純。 儀器設(shè)備 UV—4802 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司）； SK3200H超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司； ZHT 型自動(dòng)恒溫電熱套，山東鄄城永興儀器廠； WC/0905 超級恒溫箱；恒溫水浴鍋； FC204 電子天平等 實(shí)驗(yàn)方法 粗多糖的制備 稱取干燥的真姬菇 10g 粉碎，研磨，置于燒杯中加 40 倍的蒸餾水，混勻，超聲波 15min 后于 90℃ 恒溫水浴鍋中攪拌浸提 3h，減壓抽濾，提取液置于燒杯中，殘?jiān)酝瑯拥姆椒ㄌ崛。喜纱翁崛∫?，濃縮至原來體積的三分之一，將濃縮液加到三倍體積的無水乙醇中醇沉 24 小時(shí)，減壓抽濾，沉淀物依次用 95%乙醇，丙酮洗滌， 60℃ 烘箱干燥，即得到真姬菇粗多糖。 將新鮮香菇撕碎烘干，稱取 9g，粉碎，置于燒杯中加入 20 倍體積的蒸餾水混勻，在 80℃ 恒溫水浴鍋中攪拌浸取 5h，減壓抽濾，提取液置于燒杯中，濃縮至原來體積的三分之一，將濃縮液加入三倍體積的無水乙醇醇沉 24h，減壓抽濾，用無水乙醇洗滌，將沉淀于 60℃ 烘箱中干燥稱重，得香菇粗多糖。 稱取干木耳 10g，粉碎，置于燒杯中加 60 倍體積的蒸餾水，混勻在 80℃ 水浴鍋中攪拌浸取 4h，減壓抽濾，提取液置于燒杯中，濃縮至原體積的三分之一，將濃縮液加入三倍體積的無水乙醇醇沉 24h，減壓抽濾，用無水乙醇洗滌，將沉淀于 60℃ 烘箱中干燥稱重，得木耳粗多糖。 稱取裙帶菜 10g，粉碎，置于燒杯中加 20 倍體積的蒸餾水煎煮 1h，共煎煮三次，合并濾液，置于燒杯中，提取液置于燒杯中，濃縮至原體積的三分之一，將濃縮液加入三倍體積的無水乙醇醇沉 24h，減壓抽濾，用無水乙醇洗滌，將沉淀于 60℃ 烘箱中干燥稱重，得裙帶菜粗多糖。 清 除羥基自由基（ ?OH）活性分析方法 Fenton反應(yīng)是經(jīng)典的產(chǎn)生 ?OH的體系，可認(rèn)為能模擬人體內(nèi)產(chǎn)生 ?OH的過程，該反應(yīng)是以雙氧水為氧化劑，在亞鐵鹽作用下的氧化反應(yīng)： Fe2+ + H2O2 → Fe 3+ + ?OH + OH— 反應(yīng)產(chǎn)生的羥基可以氧化番紅使其褪色，利用分光光度法檢測吸光度變化間接測定所產(chǎn)生的羥自由基。在加入 H2O2前加入羥基自由基清除劑， Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基被清除或部分清除，體系在 520nm 波長處的吸光度降低程度相應(yīng)減少，采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在 520nm 波長處測量 被測物反應(yīng)液的吸光度并與空白液比較，從而測定被測物對 ?OH的清除作用。 反應(yīng)體系（ 1）中加入 PH=⒎ 4 的磷酸緩沖液 ⒉ 0ml，番紅（ 520μg/ml） l ，EDTANaFe（ Ⅱ ）（ ∕L） ，再加入不同濃度的樣品溶液 ， %的 H2O2 ，用蒸餾水定容至 10ml，混勻后于 37℃ 水浴中保溫 30min，在 520nm波長處測吸光度 A 值。反應(yīng)體系（ 2）中加入 PH=⒎ 4 的磷酸緩沖液 ⒉ 0ml，番紅（ 520μg/ml） l ， EDTANaFe（ Ⅱ ）（ ∕L） ，再加入不同濃度的樣品溶液 ， %的 H2O2 ，用蒸餾水定容至 10ml，振蕩搖勻后于37℃ 水浴中保溫 30min，在 520nm 波長處測吸光度 A 值。以上兩體系測定時(shí)，每個(gè)試樣做三次平行測定，取其平均值。 空白組以等體積的重蒸水代替樣品溶液，對照組以等體積的重蒸水代替樣品溶液和 EDTANaFe（ Ⅱ ）溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以清除率 E 表示： 100% ???? 空白吸光度值對照組吸光度值 空白吸光度值樣品組吸光度值E Ec50 表示清除率為 50%時(shí)的樣品濃度 清除超氧陰離子自由基（ O2?—）活 性的分析方法 利用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)，測定加入自由基清除劑對產(chǎn)生的 O2?—清除作用。鄰苯三酚在弱堿性（ TrisHClEDTA 緩沖液 PH=⒏ 2）環(huán)境中自氧化分解產(chǎn)生 O2?—的反應(yīng) 鄰苯三酚 O2?— + 其他產(chǎn)物 隨著反應(yīng)的進(jìn)行， O2?—在體系中不斷積累，致使反應(yīng)液在 320nm， 325nm，440nm 波