【文章內容簡介】 H銨鹽、硝酸鹽等；有機化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等 特殊 營養(yǎng)物質 (生長因子 ) 生 長 必 不 可 少 的__________ 酶和核酸的組成成分 維生素、氨基酸、堿基等 水 在生物體內含量很高，在低等生物體內含量更高 不僅是優(yōu)良的溶劑，而且可維持生物大 分子結構的穩(wěn)定 無機鹽 為微生物提供除碳、氮以外的各種重要元素 細胞內的組成成分，生理調節(jié)物質，某些化能自養(yǎng)菌的能源，酶的激活劑 (3)培養(yǎng)基的種類 劃分標準 培養(yǎng)基種類 特點 用途 物理性質 ______培養(yǎng)基 加凝固劑，如瓊脂 ________ 半固體培養(yǎng)基 觀察微生物的運動、分類、鑒定 ______培養(yǎng)基 微生物 ____、 ____、活菌計數、 保藏菌種 化學 成分 ______培養(yǎng)基 含化學成分不明確的 天然物質 工業(yè)生產 ______培養(yǎng)基 培養(yǎng)基成分明確 (用化學成分已知的化學物質配成 ) 分類、鑒定 用 途 ______培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中加入某種化學物質，以____不需要的微生物的生長， ____培養(yǎng)、 ____出特定微生物 (如培養(yǎng)酵母菌和霉菌，可在培養(yǎng)基中加入青霉素或鏈霉素；培養(yǎng)固氮菌可用 10 所需要的微生物的生長 無氮培養(yǎng)基，如阿須貝培養(yǎng)基 ) ______培養(yǎng)基 根據微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品 ____不同種類的微生物，如可用伊紅 —美藍培養(yǎng)基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌 (若有，菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤 ) 注意 病毒目前不能利用人工培養(yǎng)基來 培養(yǎng)，需接種在動、植物組織細胞中才能繁殖。常用于培養(yǎng)病毒的是活雞胚。 2．無菌技術 (1)概念：防止一切外來雜菌的侵入，并保持滅菌物品及無菌區(qū)域不再被污染的方法，稱為無菌技術。 注意 在微生物的實驗室培養(yǎng)中，無菌技術的核心是 ________________， ________________。 (2)無菌技術的具體內容 ① 對實驗操作的 ________、操作者的 ________________進行清潔和消毒。 ② 將用于微生物培養(yǎng)的 __________、接種用具和培養(yǎng)基等進行 ________。 ③ 為避免周圍環(huán)境中 微生物的污染，實驗操作應在 ________________進行。 ④ 實驗操作時應避免已 ________處理的材料用具與周圍的物品相接觸。 (3)消毒和滅菌的概念 ① 消毒：消毒是指使用 ________的物理或化學方法殺死物體表面或內部的 ________________(不包括芽孢和孢子 )。 ② 滅菌：滅菌是指使用 __________的理化因素殺死物體內外 ________________，包括 ____________。 ③ 消毒與滅菌的區(qū)別：兩者最大的區(qū)別是 ________________________。 拓展深 化 某些細菌在其生長發(fā)育后期，可在細胞內形成一個圓形的抗逆性休眠體，稱為芽孢。每個細菌細胞僅形成一個芽孢，故它無繁殖功能。芽孢有極強的抗熱、抗輻射、抗化學藥物和抗靜水壓的能力。芽孢的休眠能力十分驚人，可保持幾年到幾十年的生活力。 孢子是微生物產生的一種有繁殖或休眠作用的細胞。一般是單細胞，個體微小，通常是適應于從不利環(huán)境條件中存活下來，并在條件改變時產生新的營養(yǎng)體，能直接發(fā)育成新個體。 (4)消毒與滅菌的常用方法 方法 條件 作用對象 消 毒 ____ ____ 100℃ ，煮沸 5～ 6 min 殺死微生物 的營養(yǎng)細胞和一部分芽孢 ____ ____ ____ 70～ 75℃ 煮 30 min 或 80℃ 煮 15 min 不耐高溫的液體 ____ ____ ____ 70%的酒精 對雙手消毒 50%的石炭酸、來蘇水 對空氣消毒 一定濃度的乳酸、食醋 通過熏蒸對空氣進行消毒 紫外 線法 紫外線照射 30 min 物體表面或空氣中的微生物 滅 菌 ____ ____ 在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒 對接種環(huán)、接種針或其他金屬工具滅菌，也可以對試管口、瓶口滅菌 ____ ____ 在干熱滅菌箱內， 160～ 170℃ 條件下，加熱 1～ 2 h 耐高溫且需保持干燥的物品，如玻璃器皿和金屬用具等 ____ ____ ____ 在高壓蒸汽滅菌鍋內， 121℃ ， 100 kPa，滅菌 15～ 30 min 11 ____ ____ ____ 30 W 照射 30 min 小型接種室、接種箱等 二、實驗操作 (一 )配制培養(yǎng)基 1．配制原則 (1)____________(根據微生物的種類、培養(yǎng)目的等 )，如培養(yǎng)基可由簡單的無機物組成；生產用培養(yǎng)基內可加入化學成分不明確的天然物質，而分類鑒定用培養(yǎng)基內必須加入已知化學成分的物質。 (2)____________，注意各種營養(yǎng)物質的濃度和比例。 (3)____________，各種微生物適宜生長的 pH 范圍不同，細菌 ～ 、放線菌 ～ 、真菌 ～ 。 注意 ① 不同微生物對營養(yǎng)需求不同，因此，首先根據不同微生物的營養(yǎng)需求配制針對性強的培養(yǎng)基。 ② 營養(yǎng)物質濃度過低不能滿足微生物營養(yǎng)需要，過高對微生物的生長有抑制作用，另外，培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質濃度比直接影響微生物的生長繁殖和代謝產物的形成和積累，其中碳氮比 (C/N)的影響較大。例如，在谷氨酸生產中，當培養(yǎng)基中的碳源與氮源的 比為 4∶ 1 時，菌體大量繁殖，而產生的谷氨酸少；當碳源與氮源的比為 3∶ 1 時，菌體繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大增。 2．配制方法 (以制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基為例 ) (1)培養(yǎng)異養(yǎng)菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)構成 培養(yǎng)基組分 提供的主要營養(yǎng)物質 牛肉膏 g 碳源、磷酸鹽和維生素 蛋白胨 g 氮源和維生素 NaCl g 無機鹽 H2O 定容至 1 000 mL 氫元素、氧元素 (2)實驗流程 12 提醒 合格的培養(yǎng)基必須滅菌效果 好。培養(yǎng)基配制好后，要放在恒溫箱中保溫 1～ 2 d，若無菌落生長則說明制備的培養(yǎng)基是合格的。 (二 )純化大腸桿菌 純化大腸桿菌就是為了獲得大腸桿菌的純種菌落，這需在培養(yǎng)時，盡量使菌落中的菌體來自于一個大腸桿菌的分裂，即這個菌落的細菌群體由一個大腸桿菌繁殖而來，這就需接種時盡量接種單個的大腸桿菌。 1．微生物接種的方法 微生物接種的方法最常用的是 __________和 ______________兩種。 (1)____________通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的 表面。 ① 將 ________放在酒精燈火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。 ② 在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開盛有菌液的試管的 ______。 ③ 將試管口通過酒精燈的 ________。 ④ 將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中， ________一環(huán)菌液。 ⑤ 將試管口通過酒精燈的火焰，并迅速塞上棉塞。 ⑥ ________將培養(yǎng)皿皿蓋打開一條縫隙， ________將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入 ________，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。 ⑦ 灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內劃線。重復以上操作，在 三、四、五區(qū)域內劃線。注意不要將 ____________的劃線與 ________相連。 ⑧ 將 ____________，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 (2)________________則是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。 ① 系列稀釋操作 a．取盛有 9 mL 水的 6 支試管滅菌，并按 101～ 106 的順序編號。 b．用 ________吸取 1 mL 培養(yǎng)的菌液，注入 101 倍稀釋的試管中。用手指輕壓移液管上的橡皮頭，吹吸三次，使菌液與水充分混勻。 c．從 101 倍稀釋的試 管中吸取 1 mL 稀釋液，注入 102 倍稀釋的試管內吹吸均勻，獲得 102 倍液。依此類推。 ② 涂布平板操作 a．將 ________浸在盛有酒精的燒杯中。 b．取不超過 mL 的 ________，滴加到培養(yǎng)基表面。 c．將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻 8～ 10 s。 d．用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉動培養(yǎng)皿，使菌液分布均勻。 2．注意事項 (1)平板劃線法 ① 操作第一步即取菌種之前及每次劃線之前都需要進行 ________________，劃線操作結束時，仍需灼燒________。 ② 從第二次以后的劃線操作總是從 ________________開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加逐漸減少，最終得到由單個細菌繁殖而來的菌落。 (2)稀釋涂布平板法 稀釋涂布平板的操作比較復雜，且各個細節(jié)均需保證 “________”，應特別注意： ① 酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適。 ② 吸管頭不要接觸任何其他物體。 ③ 吸管要在酒精燈火焰周圍使用。 3．微生物分離純化培養(yǎng)的結果作出分析與評價 (1)培養(yǎng)未接種培養(yǎng)基的作用是對照，若有菌落形成，說明培養(yǎng)基滅菌不徹底。 (2)在肉湯培養(yǎng)基上，大腸桿菌菌落呈 白色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊。 13 (3)培養(yǎng) 12 h 和 24 h 后的菌落大小不同，菌落分布位置相同。原因是時間越長，菌落中細菌繁殖越多，菌落體積越大，而菌落的位置不動，只是菌落數增多。 (4)頻繁使用的菌種利用臨時保藏法保存，長期保存菌種的方法是甘油管藏法。前者利用固體斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，保存在 4℃ 冰箱中，第 3～ 6 個月轉種培養(yǎng)一次，缺點是保存時間較短，菌種容易被污染或產生變異；后者將菌種與無菌甘油等量混合后保存在－ 20℃ 的冷凍箱中。 4．菌種的保存 為了保持菌種的純凈，需對菌種進行保藏。對于頻繁使用的菌種， 我們可以采用 ________________法；對于需要長期保存的菌種，可以采用 ________________法。將菌種放在低溫環(huán)境中保藏的目的是________________________，但時間長了菌種還是要老化的，因此對臨時保存的菌種 ________個月后需重新接種。 知識點一 培養(yǎng)基與無菌技術 1．不同的微生物對營養(yǎng)物質的需要各不相同。下列有關一種以 CO2 為唯一碳源的自養(yǎng)微生物營養(yǎng)的描述中，不正確的是 ( ) A．氮源物質為該微生物提供 必要的氮素 B．碳源物質也是該微生物的能源物質 C．無機鹽是該微生物不可缺少的營養(yǎng)物質 D．水是該微生物的營養(yǎng)要素之一 2．下列說法正確的是 ( ) A．培養(yǎng)基是為微生物的生長繁殖提供營養(yǎng)的基質 B．培養(yǎng)基只有兩類：液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基 C．除水以外的無機物只能提供無機鹽 D．無機氮源不可能提供能量 知識點二 大腸桿菌的純化培養(yǎng) 3．有關平板劃線操作的敘述，不正確的是 ( ) A．第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物 B．每次劃線前，灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上的菌 種 C．在第二區(qū)域內劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于菌液 D．劃線結束后，灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者 4．下列為某同學在培養(yǎng)金黃色葡萄球菌實驗中的部分操作步驟，其中正確的是 ( ) A．培養(yǎng)基中蛋白胨、牛肉膏溶化后，直接補充蒸餾水至 100 mL B．培養(yǎng)基配制完畢可直接使用 C．加壓至 100 kPa 之前，要徹底排出鍋內的冷空氣 D．將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒，滅菌后立即伸入菌液試管內挑取少量菌種 第 2 課時 土壤中分解尿素細菌的分離與計數 一、研究思路 1．篩選菌株 (1)實驗室中微生物篩選的原理 人為提供有利于 ________________生長的條件 (包括營養(yǎng)、溫度、 pH 等 )，同時 ________或 ________其他微生物生長。 14 (2)選擇培養(yǎng)基 在微生物學中，將允許 __________種類的微生物生長，同時 ________或 ________其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。 (3)分離分解尿素的細菌的選擇培養(yǎng)基 ① 在該培養(yǎng)基配方中，為微生物的生長提供碳源的是 ____________，提供氮源的 是 ________，瓊脂的作用是凝固劑。 ② 該培養(yǎng)基對微生物具有選擇作用。其選擇機制是 ________________________________才能在該培養(yǎng)基上生長。 ③ 土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們體內能合成 ________，將尿素分解的反應式是________________________________________________________。 Taq 細菌能忍受 93℃ 左右的高溫，是在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現的，這說明，在尋找目的菌株時，要根據 _________________________