【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 泵的液缸容積小，可至 ，因此易于清洗和更換流動(dòng)相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達(dá) 400 kg/cm2。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來(lái)克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說(shuō)來(lái)并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（ RSD 為 %左右，串聯(lián)泵為 ~%），但出故障的機(jī)會(huì)較多（因多一單向閥），價(jià)格也較貴。 各品牌輸液泵的基本參數(shù)： 項(xiàng)目 Waters 515型 HP 1100型 LC10ATvp型 Elite P200 II型 檢定要求 流速范圍 ~10 ~10 ~ ~ 調(diào)節(jié)精度 流量精密度 % %（ %） % % % 流量準(zhǔn)確度 177。% 177。% 177。% 最高壓力 4000 Psi 40 MPa 密封圈壽命 流動(dòng)相的脈沖 2．泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng) 為了延長(zhǎng)泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操作： ① 防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過(guò)，可采用 Millipore 濾膜（ amp。micro。m 或 amp。micro。m）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。 ② 流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其 是在停泵過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間的情況下。如果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對(duì)于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇 水）。 ③ 泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。 ④ 輸液泵的工作壓力決不要超過(guò)規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生企業(yè) ()大量管理資料下載 漏液。 ⑤ 流動(dòng)相應(yīng)該先脫氣，以免在泵 內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無(wú)法正常工作。 如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障： ① 沒(méi)有流動(dòng)相流出，又無(wú)壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時(shí)可打開(kāi)泄壓閥，使泵在較大流量（如 5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個(gè) 50ml 針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個(gè)可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。 ② 壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時(shí)可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?，這時(shí)，可卸 下砂濾棒浸入流動(dòng)相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如 4mol/L 硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。 ③ 壓力過(guò)高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時(shí)應(yīng)逐段進(jìn)行。 3．梯度洗脫 HPLC 有等強(qiáng)度 (isocratic)和梯度 (gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和 pH 值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差 異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。 梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。 兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。 在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來(lái)一些特殊問(wèn)題，必須充分重視： ① 要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例 內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。 ② 梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來(lái)。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。 ③ 混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此 要注意防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。 ④ 每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓 10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。 二、進(jìn)樣器 早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處。現(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。 HPLC 進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。 1．隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門(mén)設(shè)計(jì)的與色 譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價(jià)格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如 10MPa 以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生企業(yè) ()大量管理資料下載 記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到 1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。 2．停流進(jìn)樣?？杀苊庠诟邏合逻M(jìn)樣。但在 HPLC 中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn) “ 鬼峰 ” ；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。 3．閥進(jìn)樣。一般 HPLC 分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國(guó) Rheodyne 公司的 7725 和 7725i型最常見(jiàn)），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降 5~10%左右），但耐高壓（ 35~40MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（ %），操作方便。 六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。 ① 用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的 50%（最多 75％），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬。② 用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不小 于定量環(huán)體積的 5~10 倍（最少 3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動(dòng)相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。 六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)： ① 樣品溶液進(jìn)樣前必須用 amp。micro。m 濾膜過(guò)濾，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。 ② 轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過(guò)泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過(guò)高的壓力將使柱頭損壞。 ③ 為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。 4．自動(dòng)進(jìn)樣。用于大量樣品的常 規(guī)分析。 三、色譜柱 色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于 HPLC 的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹(shù)脂）、多孔碳等，其粒度一般為 3,5,7,10μm 等，柱效理論值可達(dá) 5~16 萬(wàn) /米。對(duì)于一般的分析只需 5000 塔板數(shù)的柱效；對(duì)于同系物分析，只要 500 即可；對(duì)于較難分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá) 2 萬(wàn)的柱子，因此一般 10~30cm 左右的柱長(zhǎng)就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。 柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起 30 倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。 1．柱的構(gòu)造 色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高 于 70 kg/cm2 時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過(guò)拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑~20amp。micro。m(5~10amp。micro。m)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。 色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類(lèi)，尺寸規(guī)格也不同： ① 常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑 2~5mm（常用 ，國(guó)內(nèi)有 4mm 和 5mm），柱長(zhǎng) 10~30cm； ② 窄徑柱（ narrow bore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱 semimicrocolumn），內(nèi)徑 1~2mm，柱長(zhǎng) 10~20cm； ③ 毛細(xì)企業(yè) ()大量管理資料下載 管柱（又稱微柱 microcolumn），內(nèi)徑 ~； ④ 半制備柱，內(nèi)徑＞ 5mm； ⑤ 實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑 20~40mm，柱長(zhǎng) 10~30cm； ⑥ 生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根 據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來(lái)確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。 2．柱的發(fā)展方向 因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長(zhǎng) 3~10cm，填料粒徑 2~3amp。micro。m。為提高 分析靈敏度，與質(zhì)譜 (MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于 的微徑柱（ microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是： ① 節(jié)省流動(dòng)相； ② 靈敏度增加； ③ 樣品量少； ④ 能使用長(zhǎng)柱達(dá)到高分離度； ⑤ 容易控制柱溫； ⑥ 易于實(shí)現(xiàn) LCMS 聯(lián)用。 但由于柱體積越來(lái)越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測(cè)器（甚至采用柱上檢測(cè)），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出 1~100amp。micro。l/min 的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏 度的檢測(cè)器，電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。 3．柱的填充和性能評(píng)價(jià) 色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度＞ 20amp。micro。m 時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜ 20amp。micro。m 時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有 4 種： ① 高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；② 徑向加壓法， Waters 專利； ③ 軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱； ④ 干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。 必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本 問(wèn)題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。 無(wú)論是自己裝填的還是購(gòu)買(mǎi)的色譜柱，使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對(duì)稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說(shuō)來(lái)容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在 177。5% 或 177。10% 以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。 一份合格的色譜柱評(píng)價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長(zhǎng)、內(nèi)徑、填料的種類(lèi)、粒度、色譜柱的柱效、不對(duì)稱 度和柱壓降等。 4．柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng) 色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱。 ① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）。 ② 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧? ③ 一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn) 者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。 ④ 選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是 pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠 “ 飽和 ” ，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。 ⑤ 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。 企業(yè) ()大量管理資料下載 ⑥ 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清 洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的 20 倍左右，即常規(guī)分析需要 50~75ml。 下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲