【文章內(nèi)容簡介】 ，菌體較大，周圍環(huán)繞莢膜。陳舊培養(yǎng)物經(jīng)孔雀綠芽胞染色可見到大量的細菌芽胞。莢膜染色：在玻片上涂組織液，或莢膜菌培養(yǎng)物，自然干燥。置純甲醇或乙醇中固定1min，取出晾干。滴加多色美藍染料染色3～5min，在次氯酸鹽中脫色。水洗，吸干，油鏡觀察。菌體呈現(xiàn)藍色，莢膜呈現(xiàn)紅色。所有標(biāo)本都應(yīng)立即涂片，染色，進行顯微鏡檢查。隨后進行細菌培養(yǎng)。PCR檢測：在正常的無菌標(biāo)本（如血液、腦脊液）涂片鏡檢中，未發(fā)現(xiàn)大量均一的革蘭氏陽性桿菌，而僅依靠細菌分離培養(yǎng)才能獲得可疑的炭疽桿菌的細菌時，應(yīng)盡可能進行PCR檢測。可直接使用臨床標(biāo)本進行檢測，也應(yīng)對分離獲得的培養(yǎng)物檢測，標(biāo)本可經(jīng)沸水浴10min處理，或經(jīng)蛋白酶K消化，并使用碘化鈉玻璃粉吸附以富集DNA。推薦檢測質(zhì)粒上的保護性抗原基因（pag），莢膜形成基因（cya）和染色體上的炭疽桿菌特異基因（ropB）。推薦的引物序列為：pag: F:5’ATTTGCGGTAACACTTCACT3’, R:5’AGACCGTGACAATGATGGAA3’； cya: F:5’CGGATTGTATATGGAGTGGG3’,R:5’GGGACAGGAATGTTTGGATC3’； ropb: F:5’GTACGCCAATCGATATCATG3’, R:5’GATCATCGTCATCTTCCG TA3’。 PCR反應(yīng)體系為50181。l，包括下列成分：10反應(yīng)緩沖液，5181。l；4dNTP混合物（）， 4181。l；引物（上游），1181。l，引物（下游），1181。l；內(nèi)部對照模板，1181。l；待測模板，1181。l；無菌去離子水，；Taq DNA 聚合酶，1ｕl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，1個循環(huán)，之后95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃1 min。30個循環(huán)。最后72℃延伸5 min。結(jié)果分析：采用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，讀膠儀檢測。由于PCR技術(shù)有時會出現(xiàn)交叉污染和假陽性反應(yīng)，應(yīng)采取抗污染的PCR擴增方法，并對檢測結(jié)果進行必要的PCR產(chǎn)物序列測定，以排除污染。【標(biāo)本采集時注意事項】此操作規(guī)范應(yīng)在生物安全二級實驗室內(nèi)進行。采集的標(biāo)本不得用解剖的方式獲取。所需的血液與組織標(biāo)本，均應(yīng)以穿刺方式取得。盡可能在抗生素治療開始前采取標(biāo)本。根據(jù)炭疽病例的不同型別酌情采集病灶標(biāo)本。皮損部位標(biāo)本的采集：皮膚炭疽水泡期時，注意無菌操作，以無菌棉簽從未破潰水泡內(nèi)沾取水泡液（水泡期內(nèi)以革蘭氏染色法較易發(fā)現(xiàn)炭疽桿菌）；在結(jié)痂期時，收集焦痂組織時需小心提起外層的焦痂組織，以無菌棉簽取焦痂組織轉(zhuǎn)動棉簽2～3 s，以保證有足夠的標(biāo)本。血培養(yǎng)：無菌條件下采集全血5～10ml。糞便：運送大便標(biāo)本應(yīng)注意放置在清潔、干燥，無菌和密閉的容器內(nèi)，標(biāo)本應(yīng)大于5 g。對部分無法收集糞便標(biāo)本的患者，可以肛試子插入肛門1英寸采取標(biāo)本。痰培養(yǎng)：收集痰標(biāo)本應(yīng)大于1ml，應(yīng)以無菌密封容器運送。無痰液者，應(yīng)取培養(yǎng)基、打開平皿蓋，將積液置于距離患者口鼻10cm處；令患者對平皿咳嗽，然后迅速蓋上平皿。其他體液標(biāo)本：胸腔積液或腦脊液等標(biāo)本，按照規(guī)定的程序穿刺取得。尸體標(biāo)本：患者死于炭疽時，可通過穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實質(zhì)臟器獲得組織標(biāo)本?！緲?biāo)本運輸及儲存】拭子：室溫直接運輸至實驗室，如運輸時間超過1h，在2～8℃運輸。糞便：1h內(nèi)運輸新鮮大便至實驗室，如運輸時間超過1h，在2～8℃運輸。痰液：以無菌有蓋的容器常溫運送，如運輸時間超過1h，在2～8℃運輸。血培養(yǎng)標(biāo)本：室溫直接運輸至實驗室。【標(biāo)本培養(yǎng)的操作】按標(biāo)準(zhǔn)操作程序進行。所有污染的和陳舊的標(biāo)本，均應(yīng)首先制成懸液。根據(jù)標(biāo)本中含炭疽桿菌量的多少，可將懸液適當(dāng)稀釋，或經(jīng)自然沉淀除去粗大沉淀物后，再以10000 g/min離心5min，取富集的沉淀物。將所得的懸液沸水浴加熱15min后涂布平板。培養(yǎng)過程：適宜溫度35℃～37℃；環(huán)境氣體：潔凈空氣或少量CO2。培養(yǎng)周期，至少培養(yǎng)3天，每日觀察，在培養(yǎng)18～24h內(nèi)即可開始觀察，少數(shù)炭疽桿菌在培養(yǎng)8h后即生長。菌落特點：一般在SBA培養(yǎng)平板培養(yǎng)15～24h，生長完好的菌落大約直徑2～5mm。菌落呈平或不規(guī)則的突起，邊緣略不規(guī)則，毛玻璃外觀，菌落邊緣有“逗號”形，顯微鏡下觀察邊緣呈明顯 “獅頭樣”菌落。血平板上炭疽桿菌不溶血，過度生長的菌落有輕微溶血，但與β溶血鏈球菌有明顯區(qū)別。需對照觀察在SBA和MAC培養(yǎng)基的生長，因炭疽桿菌在SBA培養(yǎng)基生長良好而在MAC培養(yǎng)基不生長。炭疽桿菌生長迅速，接種濃度高的局部，6～8h可以看到菌落生長，個別或可在12～15h內(nèi)看到菌落生長，利用這一特性，可以將炭疽桿菌與其它生長較慢的細菌進行區(qū)分。炭疽桿菌鑒定：含上述可疑菌落取出，劃線接種于平板之上，在劃線區(qū)內(nèi)一處滴1滴診斷用炭疽噬菌體，另一處貼一片青霉素紙片。37℃孵育8～24h后，在噬菌體處有透明噬菌斑，青霉素紙片周圍有明顯的抑菌環(huán)，便可判定接種物為炭疽桿菌。三、免疫學(xué)檢查在從患者標(biāo)本中未獲得炭疽桿菌陽性和分離結(jié)果的情況下，可依據(jù)血清學(xué)檢驗結(jié)果確定對患者的診斷。首份血清應(yīng)在首次檢視患者時采取，通常應(yīng)一次采取血液標(biāo)本供涂片鏡檢、細菌分離培養(yǎng)、血清學(xué)抗體檢查及常規(guī)的血液檢查使用。血清分離后置4℃保存，應(yīng)在5天內(nèi)完成檢測。如超過5天，應(yīng)放置于20℃冰箱保存?；謴?fù)期血清應(yīng)在發(fā)病后15天左右采取?；謴?fù)期血清應(yīng)在發(fā)病后15日左右采取。（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）采用酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測患者血液內(nèi)炭疽桿菌保護性抗原的抗體，試驗方法如下。滴定板包被：所用各孔加入炭疽桿菌保護性抗原（PA）液（）100 μl，酶標(biāo)板貼上封口膜，置4℃過夜。次日，棄孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌緩沖液100 μl，洗滌3次，每次3 min。洗滌緩沖液配方為：Tris g1 M HCl13 mlTween20（％） ml加蒸餾水至1000 ml待檢血清：樣本的初篩：每孔加入100 μl待測血清，按倍比稀釋（稀釋液為生理鹽水）至1∶8，置37℃ 60 min。棄孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌緩沖液100 μl，洗滌3次，每次3 min (同時做空白、正常血清對照) 。復(fù)判：每份陽性血清做雙復(fù)孔檢測其滴度，增加測定結(jié)果的可分析性。耦聯(lián)酶標(biāo)記：于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的工作濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記SPA 或抗人IgG100 μl，酶標(biāo)板貼上封口膜，置37℃ 60 min。棄孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌緩沖液100 μl，洗滌3次，每次3 min。顯色：于各反應(yīng)孔中加入等體積混合的顯色底物A、B溶液100 μl，酶標(biāo)板貼上封口膜，置暗處20 min。于各反應(yīng)孔中加入顯色終止液（ M H2SO4）100 μl終止反應(yīng)。底物A液（磷酸鹽檸檬酸緩沖液，）配方為： M Na2HPO4(／L) ml M檸檬酸(／L) mlH2O2%蒸餾水50 ml底物B液（TMB〈四甲基聯(lián)苯胺〉使用液）配方為：TMB g檸檬酸 gEDTA g甘油2000 mlDMSO300 ml加熱溶解后加蒸餾水至10000 ml結(jié)果判斷：實驗結(jié)果可用酶標(biāo)儀判讀，被檢孔吸光度（A），可判斷為陽性。注：技術(shù)說明⑴ 在從患者標(biāo)本中未獲得炭疽芽胞桿菌陽性和分離結(jié)果的情況下，可依據(jù)血清學(xué)檢測結(jié)果，確定對患者的診斷。⑵ 目前多采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行炭疽特異性抗體檢測，一般用捕捉法進行，即酶標(biāo)板孔用適量炭疽毒素抗原包被，加入1