聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用(存儲(chǔ)版)
【正文】 靶序列的原因，引物不得不含有 過(guò)高 的 GC堿基，那么就 在其 5’ 端設(shè)計(jì)一串 A或 T； 同樣，如果引物中的 AT含量過(guò)高，就在其 5’ 端設(shè)計(jì)一串 G或 C， 以便將整條引物的 GC含量控制在合適的范圍內(nèi)。 引物 3’ 端 子序列也是隨機(jī)多樣性的。 引物的在線設(shè)計(jì)工具及免費(fèi)軟件簡(jiǎn)介 其它的在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站 WWW GeneFisher Web Primers Project DOPE2 NetPrimer OligosULike Primers3 PCR引物的使用 PCR引物 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： mM， 最好 mM 特異性的改進(jìn)： 降低 引物 和 dNTP的濃度可以在很大程度上改 有效性的改進(jìn)： 增加引物與模板的分子比； 如果引物中有不配 善 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，高濃度的引物往往會(huì)導(dǎo)致非特異性 的退火及副產(chǎn)物形成，同時(shí)也會(huì)促進(jìn)引物二聚體的產(chǎn)生。 由于 Mg+2 能與 dNTPs形成可溶性的復(fù)合物，過(guò)低濃度的 Mg+2離子將會(huì)影響 dNTPs的有效濃度。過(guò)長(zhǎng)的退火時(shí)間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量， 只會(huì)增加非特異性引物雜交的可能性。 對(duì)于 100ml以下的反應(yīng)體積還應(yīng)該用油封頂，以減少反應(yīng)體系的 蒸發(fā)濃縮效應(yīng)。 一個(gè)典型的原位 PCR程序包括下列四個(gè)步驟： 待檢測(cè)的組織或細(xì)胞用甲醛溶液固定 用蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透性處理，確保 PCR試劑能進(jìn)入細(xì)胞 對(duì) DNA或 RNA靶序列進(jìn)行胞內(nèi)原位擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通常用地高辛系統(tǒng)標(biāo)記， 色譜檢測(cè)儀檢測(cè) 定量 PCR（ Quantitative PCR） 理論上講， PCR產(chǎn)物以指數(shù)規(guī)律增殖，但在所有的擴(kuò)增循環(huán)（尤 其是后十輪）中，眾多引物 模板分子上的反應(yīng)由于抑制劑的作用并非 100%的有效，因此精確定量 PCR產(chǎn)物必須使用 內(nèi)標(biāo) （擴(kuò)增對(duì)照）。 采用 不對(duì)稱性 PCR程序擴(kuò)增待分析的靶基因序列，獲得特異性 單鏈 DNA， 然后在 非變性條件下走聚丙烯酰凝膠電泳，與對(duì)照樣品進(jìn)行比較 即可檢測(cè)出可能存在的堿基突變類型。 。 5’ 5’ 5’ dGTP 5’ 5‘ CCCCCCCC PCR 3‘ GGGGGGGG 5’ 5‘ CCCCCCCC 3’ PCR 5‘ CCCCCCCC 5’ 特異性引物 7 PCR技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用 特定 DNA序列的克隆與重組子的鑒定 PCRSSCP檢測(cè)基因序列 DNA洗牌術(shù)（ Shuffling） 染色體 DNA的引物原位雜交 DNA的體外定點(diǎn)突變與分析 同源重組子的檢測(cè) 特定 DNA序列的克隆與重組子的鑒定 GAATTC CTTAAG GGATCC CCTAGG PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物克隆 EcoRI BamHI PCR鑒定 DNA的體外定點(diǎn)突變與分析 PCR擴(kuò)增 突變位點(diǎn) 變性復(fù)性 除去引物 延伸 加外側(cè)引物 同源重組子的檢測(cè) 同源整合 目的基因 同源交換 目的基因 整合位點(diǎn) PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增 PCRSSCP檢測(cè)基因序列 將 PCR技術(shù)與 單鏈構(gòu)型多態(tài)性 （ SSCP） 分析技術(shù)聯(lián)合使用，可以 有效地檢測(cè)和分析基因序列的突變性質(zhì)。 不對(duì)稱 PCR中的兩條引物濃 度一般采用 50100∶ 1的配比， 在最初的 10 15個(gè)循環(huán)中，主要 產(chǎn)物還是雙鏈 DNA， 但當(dāng)?shù)蜐舛? 的引物耗盡后，高濃度引物引導(dǎo) 的 PCR反應(yīng)便會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈 原位 PCR（ In Situ PCR） 原位 PCR是 PCR技術(shù) 與原位雜交技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。 反應(yīng)體積 反應(yīng)體積 的標(biāo)準(zhǔn)范圍： 20 100 ml（ ml的小離心管 ） 有效性的改進(jìn)： 增加反應(yīng)體積以及保溫時(shí)間，以充分保證熱平衡； 5 ml的反應(yīng)體積也有成功的例子。不同 DNA聚合酶所擁有的 Tm值的差異 會(huì)改變有效的引物退火溫度。 準(zhǔn)確性的改進(jìn)： 降低 dNTPs的濃度，但要注意 Mg+2的摩爾濃度 也應(yīng)同步降低。而且能根據(jù)三種計(jì) 算方法顯示正反向引物的 Tm值，可以隨意更換堿基以提高或降低 Tm值 同時(shí)還能提供引物穩(wěn)定性的參數(shù)，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體、引物相 似性等。 盡可能高的互補(bǔ)程度是必要的。 PCR引物的設(shè)計(jì)原則 4 PCR的引物設(shè)計(jì)及合成 PCR引物的使用 引物的在線設(shè)計(jì)工具及免費(fèi)軟件簡(jiǎn)介 PCR引物的設(shè)計(jì)原則 選擇合適的引物是 PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要步驟，合適引物最基本的 引物的長(zhǎng)度 標(biāo)準(zhǔn)就是與靶序列的 高特異性雜交 。 X 10–7 X 10–6 用于 PCR的 DNA聚合酶簡(jiǎn)介 Vent DNA聚合酶具有 3’ →5 ’ 的核酸外切酶活性和校正功能，因此 與其它 DNA聚合酶（如 Taq酶 ）相比，具有相對(duì)較好的高保真性，其 出錯(cuò)率為 X 10–5 X 10–5 ； Vent DNA聚合酶（ Thermococcus litoralis） 度小于 2 kb時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度與 Mg2+的濃度并無(wú)關(guān)聯(lián)； 如果擴(kuò)增長(zhǎng)度大于 2 kb， 則需要高于 2 mM的 Mg2+， 而在擴(kuò)增長(zhǎng) 如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷， Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。 PCR反應(yīng)的 準(zhǔn)確率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞內(nèi)的 DNA聚合反應(yīng)，除了缺少完善的 DNA聚合校 正系統(tǒng)外，影響 PCR反應(yīng) 準(zhǔn)確率的因素還包括： DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA鏈的物
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