聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用-預(yù)覽頁
【正文】 DNA酶高 515倍， 度小于 2 kb時，擴增產(chǎn)物的長度與 Mg2+的濃度并無關(guān)聯(lián)； 如果擴增長度大于 2 kb， 則需要高于 2 mM的 Mg2+， 而在擴增長 如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷， Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。 準確性的改進： 建議使用高保真的 DNA聚合酶 PCR模板制備與純化 3 PCR的模板與制備 PCR模板的使用 粗樣品中的 PCR抑制劑 PCR模板制備與純化 DNA和 RNA均可作為 PCR擴增反應(yīng)的模板，但一般情況下， mRNA 先逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA再進行擴增。為達到此目的，引物設(shè)計應(yīng)注意 下列幾點： 理想的引物長度應(yīng)該在 1830個堿基之間，常見的是 2027個堿基 PCR引物的設(shè)計原則 引物的 GC含量 引物序列中的 GC含量應(yīng)在 35% 65%之間，最好在 45% 55%范 圍內(nèi)。 引物的 Ta值估算有多種公式，最好根據(jù) RCR試劑盒建議的計算方 法，例如 Alkami Quick Guide? 試劑盒建議的計算方法如下： 引物堿基 ≥ 20， Ta = + X（ GC%） 500 / 長度 5（ ℃ ） PCR引物的設(shè)計原則 杜絕互補區(qū)域的存在 引物序列和靶序列各自內(nèi)部應(yīng)杜絕互補區(qū)域的存在。 PCR引物的設(shè)計原則 選擇內(nèi)含子序列作為引物序列 在真核生物中，即便是在重復(fù)基因的不同家族成員之間，其內(nèi)含 引物的末端序列 在引物的兩端設(shè)置 12個 嘌呤堿基 ，最好在引物的 3’ 端 避免 G或 C 這樣可以在聚合反應(yīng)開始時增加引物后面堿基摻入的機會。 只要在網(wǎng)頁上相應(yīng)的位置中鍵入不超過 15個堿基的短核苷酸序列、所 期望的氨基酸序列、以及允許替換的最大堿基數(shù)，設(shè)計工具便會提供 滿足初始要求的所有可能的引物序列，還能顯示酶切位點的消失或增 加。缺點是不能計算發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體的響應(yīng) Tm值。 5 PCR反應(yīng)的其它控制參數(shù) 脫氧三磷酸核苷酸（ dNTPs） 預(yù)熱變性溫度和時間 Mg+2離子 退火雜交溫度和時間 延伸聚合溫度和時間 循環(huán)次數(shù) 反應(yīng)體積 脫氧三磷酸核苷酸（ dNTPs） dNTPs的標準使用范圍： 20 200 mM 特異性的改進： 降低 dNTPs的濃度，但要注意 Mg+2的摩爾濃度 有效性的改進： 對于較大分子量的模板，應(yīng)適當(dāng) 提高 dNTPs的量 如果一種 dNTP的濃度過高，它就會優(yōu)先摻入到延長鏈中，造成 擴增產(chǎn)物的不準確，因此要保持四種 dNTPs的 一致 。 Mg+2離子 Mg+2的標準使用范圍： 10 mM 特異性的改進： 降低 Mg+2濃度，但要注意過低的 Mg+2濃度又會影 有效性的改進： 提高 Mg+2濃度，但過量 Mg+2將 導(dǎo)致非特異性擴增 游離的 Mg+2離子濃度應(yīng) 高于 dNTPs總濃度 。 響 擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量。 特異性的改進： 提高退火溫度（比建議退火溫度提高 25℃ ）； 減少退火時間。 循環(huán)次數(shù) 在一定的循環(huán)次數(shù)下， PCR反應(yīng)的最終產(chǎn)量可由下式估算： 由上式可以看出， PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴增，但當(dāng)然產(chǎn)物拷貝數(shù)達到 1012（閾值）時 產(chǎn)物的擴增速度一般急劇下降。反應(yīng)體積過大會影響加熱和冷 卻，而過小的反應(yīng)體積又容易導(dǎo)致溫度變化不穩(wěn)定，進而降低產(chǎn) 量，甚至反應(yīng)管的幾何尺寸、管壁厚薄、擴增儀的加熱冷卻裝置 也能影響各循環(huán)步驟所需的時間。 KlenTaq∶ Pfu = 16∶ 1 KlenTaq∶ DeepVent = 50∶ 1 RT PCR（ Reverse Transcriptase） RTPCR是一種以 mRNA為模板，經(jīng) cDNA擴增出 DNA的技術(shù)， 能極其靈敏地檢測到任何基因的轉(zhuǎn)錄物，而與 mRNA的相對量無關(guān)。原位雜交技術(shù) 可以檢測到 10個拷貝的 DNA或細胞，而原位 PCR技術(shù)能 使雜交的靈敏 度提高 10倍，也就是說人們可以在 1mg的細胞 DNA樣品中檢測到 1個拷 貝的特定 DNA序列。 C0 / X0 = Cn / Xn X0 = C0（ Cn / Xn ） 其中， C0和 X0分別為內(nèi)標和待測樣品的初始拷貝數(shù)，在 1∶ 10到 10∶ 1的范圍內(nèi)最佳； Cn / Xn分別為內(nèi)標和待測樣品的擴增產(chǎn)物分子比 多重 PCR（ Multi PCR） 加入多對引物，對同一 P1 P2 P3 P4 P1‘ P2’ P3‘ P4’ 正常人擴增物 病人擴增物 模板的若干區(qū)域進行同 時擴增。在 非變性 的聚丙烯酰凝膠電泳 條件下，單鏈 DNA由于分子內(nèi)的作用力而形成卷曲構(gòu)型，即便是單一堿 基的突變也會導(dǎo)致整條單鏈 DNA的 構(gòu)型發(fā)生變化，并被檢測。 DNA洗牌術(shù)（ Shuffling） 隨機切割成 20 50bp的小片段 DNA同源序列 混合退火 PCR擴增 克隆 高通量篩選 8 PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 PCR檢測病原體 PCR臨床診斷術(shù) PCR檢測病原體 臨床上檢測病原體通常有三類方法： 病原菌和病毒的生物培養(yǎng)富集 病原菌和病毒的抗原免疫檢測 病原菌和病毒核酸特征序列的 PCR檢測 相比較而言， PCR檢測 法在很多情況下不需要培養(yǎng)富集待檢測樣品 這不僅省時，更重要的是很多病原微生物難以培養(yǎng)，如某些病毒、真菌 厭氧菌、支原體等； PCR檢測 法比免疫分析法更廉價； PCR檢測 法 可以使用多重引物同時檢測若干種病原微生物
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