聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用-全文預(yù)覽
【正文】 作提供便利條件 在不影響擴增反應(yīng)特異性的前提下，可在引物的 5’ 端引入諸如限 限制性內(nèi)切酶識別位點、啟動子序列等有用的非模板序列，以便于擴 增后操作。如果因靶序列的原因，引物不得不含有 過高 的 GC堿基，那么就 在其 5’ 端設(shè)計一串 A或 T； 同樣，如果引物中的 AT含量過高，就在其 5’ 端設(shè)計一串 G或 C， 以便將整條引物的 GC含量控制在合適的范圍內(nèi)。 PCR模板的來源主要有兩大類： 純凈物 如重組質(zhì)粒、制備的染色體 DNA、 回收的 DNA片段 粗樣品 如糞便、腦脊髓液、血液、食物、動物貝殼、土壤、 尿液、唾液、福爾馬林固定劑、組織切片、膿汁、噴 嚏液、痰液等 上述粗樣品 含有大量的 PCR反應(yīng)抑制物質(zhì)，因此如何 去除 這些種類 繁多的 抑制劑 或者 添加 必要的 PCR反應(yīng) 增強劑 顯得十分重要。 出錯率 比 Vent DNA聚合酶低 2 倍； 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 UlTma是一種高保真的 DNA聚合酶，可以較高的產(chǎn)量擴增小于 3 kb的 DNA靶序列，產(chǎn)物呈平頭末端。 反應(yīng)條件； 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Tth DNA聚合酶在 Mn2+的存在下，能有效地反轉(zhuǎn)錄長度在 1000堿 基以下的 RNA； Tth DNA聚合酶在 Mg2+的存在下，能由 DNA模板合成 DNA； Tth DNA聚合酶（ Thermus thermophilus） 好地克服 RNA鏈中普遍存在二級結(jié)構(gòu)的難題。 DNA聚合 酶的堿基摻入錯誤可能發(fā)生在其延伸階段的五種活性： 與 dNTP的結(jié)合特異性 磷酸二酯鍵的形成速率 焦磷酸的釋放速率 堿基錯誤摻入之后的持續(xù)延伸性 3’ →5 ’ 的核酸外切活性的強弱 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Taq DNA酶的聚合出錯率較高（ ），因為它沒有 3’ →5 ’的 的核酸外切酶活性和校正功能。 PCR技術(shù)的基本原理 5‘ 5‘ 待擴增 DNA區(qū)域 5‘ 變性 加熱 5‘ 5‘ 引物 退火 5‘ 5‘ 底物 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 加熱 變性 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 退火 引物 底物 聚合 加熱 變性 引物 退火 底物 聚合 1 2 3 5‘ 5‘ 5‘ PCR技術(shù)的反應(yīng)條件 DNA或 RNA模板 5‘ 5‘ 待擴增 DNA區(qū)域 5‘ 94℃ 5 min 5‘ 5‘ 55℃ 退火 5‘ 5‘ 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 循環(huán) 2530次 目標(biāo) DNA片段達 106107 變性 70℃ DNA引物 DNA聚合酶 dNTPs Mg2+（ 緩沖液） PCR反應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo) PCR反應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有： 特異性（序列選擇） 有效性（序列產(chǎn)量） 上述三大標(biāo)準(zhǔn)并非由單一因素所決定，因此在 PCR反應(yīng)中必須 準(zhǔn)確性（序列對錯） 對多種參數(shù)進行聯(lián)合控制和改進，但由于 PCR反應(yīng)中的各參數(shù)往往 是相互影響的，因此任何參數(shù)的改進不可能同時滿足特異性、有效 性、準(zhǔn)確性。 1985年 ， 美國 PEcetus公司人類遺傳研究室的 Kary mullis發(fā)明了具有劃時代意義的 PCR技術(shù)； 1988年 ， 美國 PEcetus公司推出世界上第一臺 PCR熱循環(huán)儀，從而使 PCR反應(yīng)自動化； 1993年 ， Kary mullis因發(fā)明 PCR技術(shù)獲得 諾貝 爾化學(xué)獎； 1995年 ， 定量 PCR儀誕生，使定量研究 DNA靶序列成為現(xiàn)實。相關(guān)研究結(jié)果表明， DNA聚合酶的 出錯率在每輪延伸每核苷酸 X 10–6 X 10–4范圍內(nèi)。 Taq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） 錯誤類型是由 AT轉(zhuǎn)換為 GC； 如果模板 DNA具有形成二級結(jié)構(gòu)的可能性 避免稀釋保存 Taq DNA聚合 酶 Taq DNA聚合 酶在室溫下也具有延伸引物的活性 Taq DNA酶在使用時應(yīng)注意： 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 KlenTaq DNA聚合酶 是一種 N端缺失了 的 Taq DNA聚合酶，因而 沒有 5’ 的核酸外切酶活性； KlenTaq DNA聚合酶 的 Mg2+最佳濃度范圍很寬，因此很容易優(yōu)化 KlenTaq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） 在最佳反應(yīng)條件下， KlenTaq DNA聚合酶 出錯率為 X 10–5， 性能略優(yōu)于 Taq DNA聚合酶。 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 DeepVent DNA聚合酶是一種在低溫和高溫條件下均極其穩(wěn)定的 聚合酶，且能使用廣范圍的輔助溶劑如甲酰胺和 DMSO等； DeepVent DNA聚合酶能產(chǎn)生長達 14 kb的擴增產(chǎn)物，其 外切酶 DeepVent DNA聚合酶（ Pyrococcus species GBD） 活性 比 Vent DNA聚合酶高 4 倍，聚合活性比 Taq
物理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1