聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用(文件)
【正文】 是 PCR技術(shù) 與原位雜交技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。 內(nèi)標(biāo)使用相同的引物，與待測樣品具有相似的長度、堿基組成以 及對抑制劑的敏感性，但又必須與待測樣品有所區(qū)別，以便在擴(kuò)增產(chǎn) 物檢測分析時能夠辨認(rèn)（如引物的檢測方式不同）。 5’ 5’ 5’ dGTP 5’ 5‘ CCCCCCCC PCR 3‘ GGGGGGGG 5’ 5‘ CCCCCCCC 3’ PCR 5‘ CCCCCCCC 5’ 特異性引物 7 PCR技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用 特定 DNA序列的克隆與重組子的鑒定 PCRSSCP檢測基因序列 DNA洗牌術(shù)（ Shuffling） 染色體 DNA的引物原位雜交 DNA的體外定點(diǎn)突變與分析 同源重組子的檢測 特定 DNA序列的克隆與重組子的鑒定 GAATTC CTTAAG GGATCC CCTAGG PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物克隆 EcoRI BamHI PCR鑒定 DNA的體外定點(diǎn)突變與分析 PCR擴(kuò)增 突變位點(diǎn) 變性復(fù)性 除去引物 延伸 加外側(cè)引物 同源重組子的檢測 同源整合 目的基因 同源交換 目的基因 整合位點(diǎn) PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增 PCRSSCP檢測基因序列 將 PCR技術(shù)與 單鏈構(gòu)型多態(tài)性 （ SSCP） 分析技術(shù)聯(lián)合使用，可以 有效地檢測和分析基因序列的突變性質(zhì)。 PRINS是 FISH和 PCR的結(jié)合：首先使寡聚核苷酸引物與處于 M期的 染色體 DNA退火， 然后在熒光標(biāo)記的核苷酸和 Taq DNA聚合酶的存在下 進(jìn)行延伸反應(yīng)，合成一系列長度在 2001000 bp之間 的 熒光探針，進(jìn)而 繪制細(xì)胞染色體的彩色圖譜。 。為數(shù)不 少的 PCR檢測程序已自動化，包括樣品預(yù)處理、擴(kuò)增反應(yīng)、產(chǎn)物檢測。 采用 不對稱性 PCR程序擴(kuò)增待分析的靶基因序列，獲得特異性 單鏈 DNA， 然后在 非變性條件下走聚丙烯酰凝膠電泳，與對照樣品進(jìn)行比較 即可檢測出可能存在的堿基突變類型。適用于繪制真 核生物龐大基因或基因 組中的缺失圖譜，如分 子病的臨床輔助診斷。 一個典型的原位 PCR程序包括下列四個步驟： 待檢測的組織或細(xì)胞用甲醛溶液固定 用蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行通透性處理，確保 PCR試劑能進(jìn)入細(xì)胞 對 DNA或 RNA靶序列進(jìn)行胞內(nèi)原位擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通常用地高辛系統(tǒng)標(biāo)記， 色譜檢測儀檢測 定量 PCR（ Quantitative PCR） 理論上講， PCR產(chǎn)物以指數(shù)規(guī)律增殖，但在所有的擴(kuò)增循環(huán)（尤 其是后十輪）中，眾多引物 模板分子上的反應(yīng)由于抑制劑的作用并非 100%的有效，因此精確定量 PCR產(chǎn)物必須使用 內(nèi)標(biāo) （擴(kuò)增對照）。 標(biāo)準(zhǔn)的 RTPCR程序包括： mRNA的分離 cDNA反應(yīng)的引物退火 mRNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA cDNA的 PCR擴(kuò)增 引物選擇有三種戰(zhàn)略： 基因特異性引物化（ GSP）， 最精確最靈敏 寡聚 dT引物化 隨機(jī)六聚體引物化 反向 PCR（ Inverted PCR） 通常 ， PCR反應(yīng)是對兩條引物之間 的序列進(jìn)行擴(kuò)增，但如果將模板 DNA稍 酶切 環(huán)化 酶切 擴(kuò)增 做處理，即可實(shí)現(xiàn)對已知序列兩側(cè)的片 段進(jìn)行擴(kuò)增，這種戰(zhàn)略稱為 反向 PCR技 術(shù) 。 對于 100ml以下的反應(yīng)體積還應(yīng)該用油封頂，以減少反應(yīng)體系的 蒸發(fā)濃縮效應(yīng)。達(dá)到這個階段所需要的循環(huán)次數(shù)可由下式計(jì)算： 影響上述擴(kuò)增閾值的主要因素包括： 擴(kuò)增底物（引物和 dNTPs） 有效濃度的下降 Nf = N0 X 2 N 其中 N為循環(huán)次數(shù)， N0為起始拷貝數(shù)， N0為最終拷貝數(shù) Nf = N0 （ 1 + Y） N 非特異性產(chǎn)物或引物二聚體對反應(yīng)試劑的競爭作用 反應(yīng)試劑的穩(wěn)定性 擴(kuò)增產(chǎn)物抑制作用 高濃度產(chǎn)物的退活作用以及不完全變性 特異性的改進(jìn)： 降低循環(huán)次數(shù)，減小擴(kuò)增片段長度。過長的退火時間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量， 只會增加非特異性引物雜交的可能性。 預(yù)熱變性溫度和時間 預(yù)熱溫度和時間 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 92 96℃ 30 secs 10 mins 在酶不存在時，預(yù)熱能滅活樣品中有害的蛋白酶和核酸酶，同時 又能保證模板的完全變性，尤其是基因組 DNA直接作為模板使用 時，更顯得重要。 由于 Mg+2 能與 dNTPs形成可溶性的復(fù)合物，過低濃度的 Mg+2離子將會影響 dNTPs的有效濃度。此外，保 持四種 dNTPs的濃度 略高于 DNA聚合酶對各種 dNTPs的 Km值也 很重要（ 1015 mM）。 引物的在線設(shè)計(jì)工具及免費(fèi)軟件簡介 其它的在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站 WWW GeneFisher Web Primers Project DOPE2 NetPrimer OligosULike Primers3 PCR引物的使用 PCR引物 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： mM， 最好 mM 特異性的改進(jìn)： 降低 引物 和 dNTP的濃度可以在很大程度上改 有效性的改進(jìn)： 增加引物與模板的分子比； 如果引物中有不配 善 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，高濃度的引物往往會導(dǎo)致非特異性 的退火及副產(chǎn)物形成，同時也會促進(jìn)引物二聚體的產(chǎn)生。但 TPG的一個明顯缺陷是不能計(jì)算引物的 Tm值并判斷其穩(wěn)定性。 引物 3’ 端 子序列也是隨機(jī)多樣性的。 為擴(kuò)增后操
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