聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用-免費(fèi)閱讀
【正文】 DNA洗牌術(shù)（ Shuffling） 隨機(jī)切割成 20 50bp的小片段 DNA同源序列 混合退火 PCR擴(kuò)增 克隆 高通量篩選 8 PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 PCR檢測(cè)病原體 PCR臨床診斷術(shù) PCR檢測(cè)病原體 臨床上檢測(cè)病原體通常有三類方法： 病原菌和病毒的生物培養(yǎng)富集 病原菌和病毒的抗原免疫檢測(cè) 病原菌和病毒核酸特征序列的 PCR檢測(cè) 相比較而言， PCR檢測(cè) 法在很多情況下不需要培養(yǎng)富集待檢測(cè)樣品 這不僅省時(shí)，更重要的是很多病原微生物難以培養(yǎng)，如某些病毒、真菌 厭氧菌、支原體等； PCR檢測(cè) 法比免疫分析法更廉價(jià)； PCR檢測(cè) 法 可以使用多重引物同時(shí)檢測(cè)若干種病原微生物。 C0 / X0 = Cn / Xn X0 = C0（ Cn / Xn ） 其中， C0和 X0分別為內(nèi)標(biāo)和待測(cè)樣品的初始拷貝數(shù)，在 1∶ 10到 10∶ 1的范圍內(nèi)最佳； Cn / Xn分別為內(nèi)標(biāo)和待測(cè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物分子比 多重 PCR（ Multi PCR） 加入多對(duì)引物，對(duì)同一 P1 P2 P3 P4 P1‘ P2’ P3‘ P4’ 正常人擴(kuò)增物 病人擴(kuò)增物 模板的若干區(qū)域進(jìn)行同 時(shí)擴(kuò)增。 KlenTaq∶ Pfu = 16∶ 1 KlenTaq∶ DeepVent = 50∶ 1 RT PCR（ Reverse Transcriptase） RTPCR是一種以 mRNA為模板，經(jīng) cDNA擴(kuò)增出 DNA的技術(shù)， 能極其靈敏地檢測(cè)到任何基因的轉(zhuǎn)錄物，而與 mRNA的相對(duì)量無(wú)關(guān)。 循環(huán)次數(shù) 在一定的循環(huán)次數(shù)下， PCR反應(yīng)的最終產(chǎn)量可由下式估算： 由上式可以看出， PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增，但當(dāng)然產(chǎn)物拷貝數(shù)達(dá)到 1012（閾值）時(shí) 產(chǎn)物的擴(kuò)增速度一般急劇下降。 響 擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。 5 PCR反應(yīng)的其它控制參數(shù) 脫氧三磷酸核苷酸（ dNTPs） 預(yù)熱變性溫度和時(shí)間 Mg+2離子 退火雜交溫度和時(shí)間 延伸聚合溫度和時(shí)間 循環(huán)次數(shù) 反應(yīng)體積 脫氧三磷酸核苷酸（ dNTPs） dNTPs的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 20 200 mM 特異性的改進(jìn)： 降低 dNTPs的濃度，但要注意 Mg+2的摩爾濃度 有效性的改進(jìn)： 對(duì)于較大分子量的模板，應(yīng)適當(dāng) 提高 dNTPs的量 如果一種 dNTP的濃度過(guò)高，它就會(huì)優(yōu)先摻入到延長(zhǎng)鏈中，造成 擴(kuò)增產(chǎn)物的不準(zhǔn)確，因此要保持四種 dNTPs的 一致 。 只要在網(wǎng)頁(yè)上相應(yīng)的位置中鍵入不超過(guò) 15個(gè)堿基的短核苷酸序列、所 期望的氨基酸序列、以及允許替換的最大堿基數(shù)，設(shè)計(jì)工具便會(huì)提供 滿足初始要求的所有可能的引物序列，還能顯示酶切位點(diǎn)的消失或增 加。 引物的 Ta值估算有多種公式，最好根據(jù) RCR試劑盒建議的計(jì)算方 法，例如 Alkami Quick Guide? 試劑盒建議的計(jì)算方法如下： 引物堿基 ≥ 20， Ta = + X（ GC%） 500 / 長(zhǎng)度 5（ ℃ ） PCR引物的設(shè)計(jì)原則 杜絕互補(bǔ)區(qū)域的存在 引物序列和靶序列各自內(nèi)部應(yīng)杜絕互補(bǔ)區(qū)域的存在。 準(zhǔn)確性的改進(jìn)： 建議使用高保真的 DNA聚合酶 PCR模板制備與純化 3 PCR的模板與制備 PCR模板的使用 粗樣品中的 PCR抑制劑 PCR模板制備與純化 DNA和 RNA均可作為 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，但一般情況下， mRNA 先逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。 Taq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） 錯(cuò)誤類型是由 AT轉(zhuǎn)換為 GC； 如果模板 DNA具有形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性 避免稀釋保存 Taq DNA聚合 酶 Taq DNA聚合 酶在室溫下也具有延伸引物的活性 Taq DNA酶在使用時(shí)應(yīng)注意： 用于 PCR的 DNA聚合酶簡(jiǎn)介 KlenTaq DNA聚合酶 是一種 N端缺失了 的 Taq DNA聚合酶，因而 沒(méi)有 5’ 的核酸外切酶活性； KlenTaq DNA聚合酶 的 Mg2+最佳濃度范圍很寬，因此很容易優(yōu)化 KlenTaq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） 在最佳反應(yīng)條件下， KlenTaq DNA聚合酶 出錯(cuò)率為 X 10–5， 性能略優(yōu)于 Taq DNA聚合酶。 1985年 ， 美國(guó) PEcetus公司人類遺傳研究室的 Kary mullis發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的 PCR技術(shù)； 1988年 ， 美國(guó) PEcetus公司推出世界上第一臺(tái) PCR熱循環(huán)儀，從而使 PCR反應(yīng)自動(dòng)化； 1993年 ， Kary mullis因發(fā)明 PCR技術(shù)獲得 諾貝 爾化學(xué)獎(jiǎng)； 1995年 ， 定量 PCR儀誕生，使定量研究 DNA靶序列成為現(xiàn)實(shí)。 DNA聚合 酶的堿基摻入錯(cuò)誤可能發(fā)生在其延伸階段的五種活性： 與 dNTP的結(jié)合特異性 磷酸二酯鍵的形成速率 焦磷酸的釋放速率 堿基錯(cuò)誤摻入之后的持續(xù)延伸性 3’ →5 ’ 的核酸外切活性的強(qiáng)弱 用于 PCR的 DNA聚合酶簡(jiǎn)介 Taq DNA酶的聚合出錯(cuò)率較高（ ），因?yàn)樗鼪](méi)有 3’ →5 ’的 的核酸外切酶活性和校正功能。 出錯(cuò)率 比 Vent DNA聚合酶低 2 倍； 用于 PCR的 DNA聚合酶簡(jiǎn)介 UlTma是一種高保真的 DNA聚合酶，可以較高的產(chǎn)量擴(kuò)增小于 3 kb的 DNA靶序列，產(chǎn)物呈平頭末端。如果因
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