【正文】 。（用 buffer保持恒定） ? 離子強度：離子強度越高， v 越低。 2. 電泳的分類 ?按 支持介質(zhì)種類 的不同，區(qū)帶電泳可分為： ① 紙電泳 ： 用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。 3. 電泳常用設備 （ 1）電泳儀 ： 為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置 。 Acr與 Bis的重量比應在 30左右。分辨率較高。 ? 區(qū)帶電泳 :（ zone electrophoresis, ZEP）指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。 2）電場強度： E越高， v越快。 固定相： 硅膠 填料是非極性的，官能團為烷烴。 ②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。 常用：溴化氰（ CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。 ④ 適當?shù)亩嗫仔浴? 3） 再生： 除去固定相吸附的雜質(zhì) ，用水或 8mol/L 脲素溶液 。 pI 蛋白 質(zhì)帶 正 電 pI 蛋白 質(zhì)帶負電 2. 陰離子交換劑分離蛋白質(zhì) 的 過程 平衡 吸附 去吸附 分離結束 再生 + 低鹽 高鹽 利用不同 鹽濃度將 不同蛋白 質(zhì) 洗 脫下 來 Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Ionexchange chromatography 3. 操作 平衡 上樣 平衡 洗脫 再生 1）上樣： 上樣體積不十分嚴格。 ? 洗速不可過快，保持恒速。 BioGel A (美國） 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結構，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結構越密集。 Ⅱ . Kd=1時 ,即 Ve=Vo+Vi， 說明該組分能進入凝膠的全部內(nèi)空隙 ，最后流出 。 羥基磷灰石 （ HA） [Ca10(PO4)6.(OH)2] : 微晶型的磷酸鈣制品， 表面有 Ca2+和 PO43兩種帶電基團； 酸性和中性蛋白質(zhì)可與 Ca2+結合；堿性蛋白質(zhì)可與 PO43結合。 在波 長 280nm具有吸光的 氨 基酸 分光比色 儀 裝置 圖 紫外吸收法 平衡、吸附 鹽 梯度 沖 洗 分管收集 蛋白 測 定 制圖 測 A280 （一）吸附層析 （ adsorption chromatography） 1. 原理 利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。 層析操作 ?分離中： 上樣： 體積盡可能小。 按操作形式不同分類： 柱層析 ：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。 二、層析法 ? 層析法也稱色譜法，是 1903年俄國植物學家 Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。 2. 透析方法及裝置 透析袋透析簡單裝置。 ? 4）破壁功能，直接從完整細胞提取酶蛋白。 第二步： 將酶蛋白從反膠束轉移到第二種水相 中，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的反萃取過程。 ?基本過程： ?1）在 SCF中，溶解度大的物質(zhì)溶于其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)分開。 ?3. 應用 ? 胞內(nèi)酶的提取和精制 : ? 除去細胞碎片，并使酶得到純化。 ? 在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑里，達到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)。 六、萃?。?extraction）分離 利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。 2. 沉淀劑： 常用 聚乙二醇 （ Polyethyene glycol，簡寫 PEG ） 多用分子量為 6000～ 20220的 PEG。某些對溫度敏感的酶，可在 0℃ ～ 4℃ 下操作 。 Ks代表鹽析效率 ，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度， Ks越大鹽析效果越好。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過 40％。 2) 鹽析 （ salting out） ： 高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。 離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，達到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。 2）壁效應嚴重。 ? 使用超速離心機時先抽真空。 RCF = m r （ 2? N/60） 2 /mg= ?105 N2 r 此公式描述了相對離心力與轉速之間的關系 旋轉半徑用 r平均 代替 r平均 =1/2（ r大 +r小 ） cm 通常： ?低速離心以 每分鐘的轉數(shù) 表示，如： 4000r/min。 b. 保持生物活性。 ? 2）表面活性劑處理： 常用非離子型表面 ?活性劑，如 Triton X100， Tween等。 第一節(jié) 酶的分離 一、發(fā)酵液預處理 (一 )發(fā)酵液的相對純化 1. 無機離子的去除 2. 雜蛋白質(zhì)的去除 3. 色素及其他物質(zhì)的去除 (二）發(fā)酵液的固液分離 1 . 影響發(fā)酵液過濾的因素 ?1）菌種 ?2）培養(yǎng)基組成 2. 提高過濾性能的方法 1）絮凝和凝聚 2）稀釋、加熱 3）加助濾劑， 常用硅藻土等。 ?濃縮與干燥 （ concentration and desiccation）（成品加工） :使酶與溶劑分離的過程。 ? 1）有機溶劑處理： 破壞膜磷脂結構，常用 ?丙酮、丁醇、氯仿等。 ? 提取目標： a. 將 目的酶最大限度地溶解出來。 一般用 g（或數(shù)字 ?g）表示。 ? 使用冷凍離心機時提前降溫，預冷離心頭。 缺點： 1） 分離效果較差， 不能一次得到純顆粒。 根據(jù) 顆粒的密度不同 而進行分離。 （四）應用 根據(jù)不同離心目的，分為 ?制備性離心： 分離純化和制備 ?分析性離心： 測分子量、沉降系數(shù)、密度、純度 五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同） ?使溶液中的溶質(zhì)由液相轉變?yōu)楣滔辔龀? ?古老、實用、簡單的初步分離方法 ?在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法： ? ⑴中性鹽沉淀（鹽析法） ? ⑵有機溶劑沉淀 ? ⑶選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性） ? ⑷等電點沉淀 ? ⑸有機聚合物沉淀 （一）鹽析沉淀法（改變離子強度） 1. 基本原理（鹽溶和鹽析） 向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象： 1) 鹽溶 （ salting in） ： 低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表 鹽析操作 ? 低飽和度： 飽和溶液滴加法。 蛋白質(zhì)量 (mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨 飽和度％ 硫酸銨濃度（ %） 枯草桿菌 ?淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線 ?4. 鹽析的影響因素 ?1) 離子強度和種類（介紹鹽析常數(shù)） 蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關系： IKSS s ??? 0l o gl o gI：離子強度， I = ∑MZ 2； M：離子濃度（ mol/L）； Z：離子價數(shù) S：離子強度為 I時的蛋白質(zhì)的溶解度（ g/L） S0：離子強度為 0時蛋白質(zhì)的溶解度（ g/L） Ks：鹽析常數(shù)，是與 蛋白質(zhì) 和 鹽種類 有關的特性常數(shù)。 ? 一般可在室溫下進行。 ?3. 優(yōu)點： ? 1） 大多數(shù)蛋白質(zhì)的 pI都在偏酸性范圍內(nèi) ? 2）無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低 ? 3）無需除掉多余酸即可進行下一步純化 ?4. 缺點： ? 酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活 ? （四）有機聚合物沉淀法 1. 作用機理： 與有機溶劑類似 ，是發(fā)展較快的一種新方法。 ? ⑶ 有機溶劑變性 ? 使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。 ?溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平衡規(guī)律 ）為基礎。 a 雙節(jié)線 系線 b 雙節(jié)線 均相區(qū) 均相區(qū) 兩相區(qū) 兩相區(qū) 系線 臨界點 PEG/Dx和 PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖 ? 幾種典型的雙水相系統(tǒng) ? 聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 ? 葡聚糖（ Dex） ? 羥丙基葡聚糖 ? 聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（ Dex） ? 硫酸葡聚糖鈉鹽 聚丙烯乙二醇 ? 羧基甲基葡聚糖鈉鹽 甲基纖維素 ? 聚乙二醇（ PEG） 磷酸鉀、 硫酸銨 ? 硫酸鈉、硫酸鎂 2. 萃取原理： 利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。 ?2) SCF粘度和擴散系數(shù)接近于氣體， ? 傳質(zhì)擴散快 。 功能 溶解非極性物質(zhì) 溶解極性物質(zhì) ? p154 2. 萃取過程 第一步： 將酶從水相中萃取到反膠束相中。 ? 3） 解決胞內(nèi)酶在非細胞環(huán)境中迅速失活問題。 2）透析袋的保存 ： 防腐劑＋冷藏。 應用： 脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。 凝膠層析 ：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。 ? 3）平衡： 層析柱使用前，須用 緩沖液 平衡至所需的 pH值和離子強度 。 蛋白 質(zhì) 定量 —— 分光比色 儀 (A280)法 蛋白質(zhì)分子中的 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基 （ 主要是 色氨酸 Trp和酪氨酸 Tyr 的 共軛雙鍵 ） 對紫外光有吸收，以 色氨酸 吸收最強，最大吸收峰為 280nm。 硅膠： 常用的極性吸附介質(zhì)。 Sizeexclusion chromatography 凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù) Kd表示： VeVo Kd=———— Vi Vo—— 外水體積 ，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ ml） Vi—— 內(nèi)水體積 ，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ ml） Ve—— 某組分的洗脫體積 ，從加進層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（ ml） 凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰 Ⅰ . Kd=0時 ,即 Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大 ， 不進入微孔 ， 最先流出 。 凝膠型號 顆粒大小/μ m 溶脹體積/(ml/g) 分離范圍（ Mr） Sephadex G10 Sephadex G15 Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G75 Sephadex G100 Sephadex G150 Sephadex G200 4～ 120 4～ 120 50～ 150 50～ 150 40～ 120 40～ 120 40～ 120 40～ 120 2～ 3