【正文】 CH2=CH C=O NH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH CH2CH[CH2CH]nCH2CH C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O CH2CH[CH2CH]nCH2CH C=O C=O NH NH2 丙烯酰胺 N,N’ 甲叉雙丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： 1）化學(xué)催化系統(tǒng)： APTEMED 催化劑： 過硫酸銨 （ ammonium persulfate， AP） 加速劑： TEMED（ N， N， N’ ， N’ 四甲基乙二胺） 2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（ TEMED） 催化劑 : 核黃素（維生素 B2） 引發(fā)劑 : 光 TEMED的存在，可加速聚合。 ③ 瓊脂糖凝膠電泳 ： 一般用于核酸的分離分析。 4）電滲： 在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。 ? 電泳技術(shù) 是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進行分離的實驗技術(shù) 。 2. 分類 按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)分類： 親和色譜： —— 親和力 吸附色譜： —— 吸附力 離子交換色譜： —— 離子交換能力 凝膠色譜 ： —— 分子大小而引起的體積排阻 分配色譜： —— 分配系數(shù) 分配色譜又可分為： 正相色譜： 固定相為極性，流動相為非極性。如：AHSepharose 4B 常用手臂 5. 操作： 1） 層析前： 制備親和層析劑 選擇 根據(jù)欲分離物質(zhì)特性 配基 選擇 根據(jù)配基分子大小及基團特性 載體 2）洗脫： 能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。 優(yōu)良配體須具備的條件： 1）與待純化的物質(zhì)有較強的親和力。 + C C C 配基 蛋白質(zhì) 固體載體 Affinity chromatography 2. 基質(zhì)的選擇 理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求： ① 高度的親水性。 1. 原理 : 在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)發(fā)生局部可逆變性，被迫與疏水層析的固定相結(jié)合在一起，然后通過降低流動相的離子強度，即可將結(jié)合于固定相的蛋白質(zhì)，按其結(jié)合力大小，依次進行解吸附。 1）離子交換劑 ： 離子交換劑由載體、電荷基團和反離子構(gòu)成。 2）柱的選擇 采用 L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速 。 1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（ dextran gel) 商品名 :Sephadex 型號 Sephadex G－ 10至 G200 G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的 10倍。 4. 應(yīng)用 分離純化生物大分子 （二）凝膠過濾層析 凝膠過濾（ gel filtration）又稱分子篩層析（ molecular sieve chromatography）、排阻層析（ exclusion chromatography） ,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的 分子量不同 而進行分離的技術(shù)。 但為了便于解吸附，對于極性強的物質(zhì)通常選用極性弱的吸附劑進行吸附。 同時進行分步收集和檢測。離子交換纖維素需作酸堿處理。 分配層析 ：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。 滲透與反滲透 Reverse Osmosis (RO) Nanofiltration (NF) Ultrafiltration (UF) Microfiltration (MF) Membrane Filtration 3. 電場膜分離 （ 1）電滲析： 在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負(fù)電極。 材料：纖維素衍生物。 ?4. 優(yōu)點 ? 1）萃取率和反萃取率高。 構(gòu)造 表面活性劑極性基團在外，非極性基團在內(nèi)，形成非極性核心。 ?臨界壓力： 在臨界溫度下，液化氣體所需要的壓力。 ?優(yōu)點： ?1） 每一水相中均有很高的含水量，為 ?酶等生物物質(zhì)提供了一個良好的環(huán)境； ?2） PEG、 Dextran和無機鹽對酶等無毒 ?害作用，不會引起變性。 萃余液： 被萃取出溶質(zhì)后的料液 。 ? ⑴ 熱變性 ? 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固， 加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。 （ 2） pH 值： 盡可能靠近其等電點。 ?4) 溫度的影響： ?稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。 ? 3）沉淀再溶解后可用超濾 （ ultrafiltration） 、透析 （ dialysis） 或?qū)游?（ chromatography） 方法脫鹽。 按下式計算，得表中數(shù)據(jù) B(S2S1) W= —————— 1AS2 A,B—— 常數(shù)，與溫度有關(guān)。 ?差速離心 是一種動力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。 ?適宜分離密度相近而大小不同的固相 物質(zhì) 。 特點： 用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 常用 S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如 16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在 1 ~ 200之間。 提取方法 ： （一）鹽溶液提取 常用稀鹽（常用 NaCl）溶液（鹽溶），對酶穩(wěn)定性好、溶解度大 ，最常用。 ： 測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。 ? 3）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。 ?初步純化 （ rough fractionation） （提取）：除去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。 ? 2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。 ? 自溶法（ autolysis） : ? 細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā) ?生溶解的現(xiàn)象。但為防止酶失活， ? 一般 采用低溫下（ 0~10℃ ） 操作。 兩者可換算或查測算圖。 角式離心機和離心頭（轉(zhuǎn)子） ? 角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。 差速離心分離示意圖 （ a）離心前的懸浮液 （ b）～（ e）離心不同時間后顆粒的沉降情況 2．密度梯度離心 （ density gradient centrifugation） 樣品在 密度梯度介質(zhì) 中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。 特點： ?介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。 不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀， 逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。不會大量增加溶液體積。 β 分級鹽析法 ： 在一定離子強度下，通過改變?nèi)芤旱?pH及溫度的沉淀方法 。 ? 1. 沉淀機理 ? 降低溶液的介電常數(shù) ? 部分地引起蛋白質(zhì)脫水 ? 2. 常用有機溶劑 ? 丙酮 ?乙醇 ?甲醇，用量一般為酶液體積的 2倍左右，終濃度為 70%。 ?② 沉淀效能高 ， 使用少量的 PEG即可沉淀相當(dāng) ? 多的生物大分子 。 溶質(zhì)： 料液中欲提取的物質(zhì) 。 ? 普通有機溶劑萃取難以進行蛋白質(zhì)的分離， ? 因為 : ?1） 蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機溶劑 ?2） 蛋白質(zhì)在有機相中易變性失活 故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)的提取 。 親和萃取酶實例 蛋白質(zhì) 配基 胰蛋白酶 胰蛋白酶抑制劑 磷酸果糖激酶 三嗪染料 甲酸脫氫酶 三嗪染料 葡糖 6磷酸脫氫酶 三嗪染料 ?（三） 超臨界流體萃取 ? 兼有蒸餾和溶液萃取的特征， 與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。 ?常用超臨界液態(tài) CO2作為萃取劑， ? 因為： ?1）液體 CO2無毒 ?2）臨界溫度（ ）接近常溫 ?3）臨界壓力（ ）較低 ?4）操作安全 ?超臨界 CO2萃取技術(shù)在生物、食品 ?等工業(yè)中的應(yīng)用 ? CO2萃取部分產(chǎn)品 ? 原料名稱 產(chǎn)物名稱 原料名稱 產(chǎn)物名稱 ? 小麥胚芽 胚芽油 豆子 豆油精煉油 ? 啤酒花 啤酒花精油 茉莉花 凈油 ? 辣椒 辣椒紅色素 菊花根 除蟲菊酯 ? 當(dāng)歸 精油 紫草 紫草寧 ? 銀杏葉 銀杏內(nèi)酯 花生 精煉油 （四） 反膠團萃取 ? 1. 反膠團： 又稱反膠束（ Reversed Micelles） ? 指 表面活性劑 （ 由親水的極性基團和疏水的非極性基團兩部分組成）分散在連續(xù) 有機 溶劑 中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體 。 ?（ 1）表面活性劑 ? 常用： AOT(Aerosol OT)（陰離子表面活性劑，琥珀酸 2乙基己基酯磺酸鈉）。 第二節(jié) 酶的精制 酶純化的基本原則： ①建立一個方便靈敏的分析方法； ②選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟； ③常在低溫（ 4℃ ）條件下進行純化，以避免酶的變性。 超濾原理的示意圖 ?利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。 ? 色譜起源 色譜 組分 色素 石油醚 碳酸鈣顆粒 用色彩（ chroma）和圖譜（ graphs）組成色譜一詞（ Chromatography) 。 薄層層析 ：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。 洗脫： 連續(xù)梯度洗脫：連續(xù)改變緩沖液的 pH或離子強度。 ?吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇 。 3. 洗脫劑 要求： 粘度小，純度高， 穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要分離的成分 ,易與目標(biāo)分子分離。 Kd小的先流出 ， Kd大的后流出 。 以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。 ? 用 %NaN3防腐。 制備純化生物大分子 圖 439 梯度溶液的制備方法和洗脫曲線 （ a）線性梯度；（ b）凸形梯度；（ c）凹形梯度；（ d）編程梯度 （四）疏水層析 （ Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 從分離純化的機制看，屬吸附層析類。 （ 五）親和層析 (Affinity Chromatography) 由吸附層析發(fā)展起來的 ，是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。 可被應(yīng)用的基質(zhì)（載體） ： （按性能優(yōu)劣排序） 瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。 如用 CNBr 作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基 2）引入連接臂 （ space arm） 又稱手臂（ spacer ） “ 接臂 ” 的目的： 克服 影響配基與生物大分子的結(jié)合的 空間障礙 。 顆粒大小對分辨率的影響 流速為 240ml/hr 流速對分辨率的影響 顆粒大小為 50－ 80目。 反相色譜中，蛋白質(zhì)按其疏水性大小進行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì)，越不易與非極性的固定相結(jié)合，先被洗脫下來