【正文】 溶質(zhì)分子 Y 從高濃度一側(cè)通過(guò)膜向低濃度一側(cè)移動(dòng) 蛋白質(zhì)透析 1. 透析膜 商品透析膜大多制成管狀 。 2. 透析方法及裝置 透析袋透析簡(jiǎn)單裝置。 常規(guī)過(guò)濾 (A)和超濾 (B)的示意圖 A B 圖 461 超濾濃縮裝置 反滲透 （ Reverse osmosis， RO） π半透膜圖14 3 利用反滲透膜選擇性地只能透過(guò)溶劑 (通常是水 )的性質(zhì)，對(duì)溶液施加壓力，使溶劑通過(guò)反滲透膜而從溶液中分離出來(lái)的過(guò)程。 二、層析法 ? 層析法也稱色譜法，是 1903年俄國(guó)植物學(xué)家 Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。 ? mobile phase：攜帶樣品流過(guò)整個(gè)系統(tǒng)的流體 stationary phase：靜止不動(dòng)的一相 層析法的分類 流動(dòng)相有兩種狀態(tài)： *液體作為流動(dòng)相 *氣體作為流動(dòng)相 固定相也有兩種狀態(tài)： *固體吸附劑作為固定相 *以吸附在固體上的液體作為固定相 ? 按兩相所處的狀態(tài)分類： 液相層析 液 固層析 液 液層析 氣相層析 氣 固層析 氣 液層析 ? 按層析過(guò)程的機(jī)理分類： 吸附層析 ：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異。 按操作形式不同分類： 柱層析 ：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。 層析設(shè)備 ? 層析裝置： ? 梯度混和器 ? 蠕動(dòng)泵 ? 層析柱 ? 監(jiān)測(cè)儀 ? 記錄儀 ? 收集器 記錄儀 低溫層析柜 層析操作 ?分離前： ? 1）樹(shù)脂預(yù)處理： 凝膠溶漲。 層析操作 ?分離中： 上樣： 體積盡可能小。 等溫平衡洗脫：用平衡緩沖液直接進(jìn)行擴(kuò)展洗脫。 在波 長(zhǎng) 280nm具有吸光的 氨 基酸 分光比色 儀 裝置 圖 紫外吸收法 平衡、吸附 鹽 梯度 沖 洗 分管收集 蛋白 測(cè) 定 制圖 測(cè) A280 （一）吸附層析 （ adsorption chromatography） 1. 原理 利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離。 ? 1）吸附劑的選擇： ? 根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為： ? 弱吸附劑：蔗糖、淀粉 ? 中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等 ? 強(qiáng)吸附劑：氧化鋁、活性炭 吸附劑的選擇根據(jù)相似相溶原則： ?極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì) ?非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。 羥基磷灰石 （ HA） [Ca10(PO4)6.(OH)2] : 微晶型的磷酸鈣制品， 表面有 Ca2+和 PO43兩種帶電基團(tuán)； 酸性和中性蛋白質(zhì)可與 Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與 PO43結(jié)合。 生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。 Ⅱ . Kd=1時(shí) ,即 Ve=Vo+Vi， 說(shuō)明該組分能進(jìn)入凝膠的全部?jī)?nèi)空隙 ，最后流出 。 2) 判斷分離效果， Kd差異大，分離效果好， Kd差異小，分離效果差。 BioGel A (美國(guó)） 依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。 將干膠懸浮于 5~10倍的 蒸餾水中 ，充分溶脹，抽氣，裝柱。 ? 洗速不可過(guò)快，保持恒速。 蛋白質(zhì)的洗脫體積與其分子量有關(guān) （三）離子交換層析 （ ion exchange chromatography， IEC） :根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離 純化方法。 pI 蛋白 質(zhì)帶 正 電 pI 蛋白 質(zhì)帶負(fù)電 2. 陰離子交換劑分離蛋白質(zhì) 的 過(guò)程 平衡 吸附 去吸附 分離結(jié)束 再生 + 低鹽 高鹽 利用不同 鹽濃度將 不同蛋白 質(zhì) 洗 脫下 來(lái) Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Ionexchange chromatography 3. 操作 平衡 上樣 平衡 洗脫 再生 1）上樣： 上樣體積不十分嚴(yán)格。 大多數(shù)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性，但分子內(nèi)部存在一個(gè)疏水核心， 欲讓蛋白質(zhì)與疏水性固定相結(jié)合在一起，可以靠蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)?。?hydrophobic patch），或讓蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性（可逆），暴露出掩藏于分子內(nèi)的疏水性殘基。 3） 再生： 除去固定相吸附的雜質(zhì) ，用水或 8mol/L 脲素溶液 。 ? 將待純化物質(zhì)的特異配體通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附， 從層析柱流出， 變換洗脫條件，即可將 欲分離的物質(zhì)洗 脫下來(lái) ，實(shí)現(xiàn)分離提純。 ④ 適當(dāng)?shù)亩嗫仔浴?如抑制劑，底物，抗體，輔酶等。 常用：溴化氰（ CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。 目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應(yīng)。 ②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。 許多類型的柱層析都可用 HPLC來(lái)代替，如離子交換層析、吸附層析、凝膠過(guò)濾等。 固定相： 硅膠 填料是非極性的，官能團(tuán)為烷烴。 3. 色譜儀組成 1）進(jìn)樣系統(tǒng) 2）輸液系統(tǒng) 3）分離系統(tǒng) 4）檢測(cè)系統(tǒng) 5）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) Principles of Operation for Chromatography Techniques Gel Filtration Ion Exchange Hydrophobic Interaction Affinity Reversed Phase 銜接層析技術(shù)時(shí)注意事項(xiàng) 層析技術(shù) 結(jié)束情況 起始條件 小量樣品 GF 低離子強(qiáng)度 IEX 高離子強(qiáng)度或 pH 改變 高離子強(qiáng)度 HIC 低離子強(qiáng)度 特異性結(jié)合 AC 特異性洗脫 樣品稀釋，緩沖液不變 第三節(jié) 電泳 ? 電泳 （ electrophoresis, EP） ： ? 指帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)的過(guò)程。 2）電場(chǎng)強(qiáng)度： E越高， v越快。 通常，緩沖液離子強(qiáng)度在 。 ? 區(qū)帶電泳 :（ zone electrophoresis, ZEP）指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。 ?以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。分辨率較高。 聚丙烯酰胺凝膠是由 丙烯酰胺單體（ acrylamide，簡(jiǎn)稱 Acr）和交聯(lián)劑 N， N’ 甲叉雙丙烯酰胺 （ methylane bisacrylamide，簡(jiǎn)稱 Bis）在 催化劑 和 加速劑 作用下聚合的。 Acr與 Bis的重量比應(yīng)在 30左右。 . 聚丙烯酰胺凝膠： 丙烯酰胺＋ N,N’ －甲叉雙丙烯酰胺聚合而成 凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性和透明度粘著度取決于凝膠總濃度（ T） 和交聯(lián)度（ C）。 3. 電泳常用設(shè)備 （ 1）電泳儀 ： 為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置 。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。 2. 電泳的分類 ?按 支持介質(zhì)種類 的不同，區(qū)帶電泳可分為： ① 紙電泳 ： 用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。 應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。（用 buffer保持恒定） ? 離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高， v 越低。 一、電泳的基本理論 1. 原理 : ? 在一定 pH條件下（用 buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。 反相色譜中，蛋白質(zhì)按其疏水性大小進(jìn)行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì)，越不易與非極性的固定相結(jié)合，先被洗脫下來(lái)。 反相色譜： 固定相為非極性，流動(dòng)相為極性。 顆粒大小對(duì)分辨率的影響 流速為 240ml/hr 流速對(duì)分辨率的影響 顆粒大小為 50－ 80目。 包括：非專一性洗脫和專一性洗脫 偶聯(lián) 親和層析劑 非專一性洗脫： 改變溫度 改變 pH值 改變離子強(qiáng)度 專一性洗脫： 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑（半抗原、抑制 劑、底物類似物） 被吸附物質(zhì)結(jié)合 競(jìng)爭(zhēng)性地與 配體結(jié)合 6. 應(yīng)用 1）純化大分子物質(zhì) 如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)）， LectinSepharose 4B 2) 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能： 分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。 如用 CNBr 作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基 2）引入連接臂 （ space arm） 又稱手臂（ spacer ） “ 接臂 ” 的目的： 克服 影響配基與生物大分子的結(jié)合的 空間障礙 。 2）具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)。 可被應(yīng)用的基質(zhì)（載體） ： （按性能優(yōu)劣排序） 瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。 ② 極低的非特異性吸附性（惰性）。 （ 五）親和層析 (Affinity Chromatography) 由吸附層析發(fā)展起來(lái)的 ，是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。 2. 吸附劑 親水性（如 Sepharose） 基質(zhì) 固定相 疏水性（如硅膠、樹(shù)脂） 配體 （疏水性基團(tuán)）（苯基、辛基、烷基） 產(chǎn)品名稱 載體 配基 生產(chǎn)公司 苯基 Sepharose 4B 瓊脂糖凝膠珠 苯基 Pharnacia 辛基 Sepharose 4B 瓊脂糖凝膠珠 辛基 Pharnacia 烷基交聯(lián)瓊脂糖凝膠珠 瓊脂糖凝膠珠 烷基(Cn) 以 色 列 一些商品疏水層析介質(zhì) 3. 操作 1） 加樣： 樣品溶液中補(bǔ)加適量的鹽。 制備純化生物大分子 圖 439 梯度溶液的制備方法和洗脫曲線 （ a）線性梯度；（ b）凸形梯度；（ c）凹形梯度；（ d）編程梯度 （四）疏水層析 （ Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 從分離純化的機(jī)制看，屬吸附層析類。 如羧甲基纖維素離子交換劑組成 纖維素 — O— CH2— COO— Na+ 載體 電荷基團(tuán) 反離子 化學(xué)原料合成 ：樹(shù)脂類物質(zhì) 載體 天然材料制成： cellulose sephadex sepharose 陽(yáng)離子交換劑 : 電荷基團(tuán)（－） , 反離子（＋） 電荷基團(tuán) 陰離子交換劑 : 電荷基團(tuán)（＋） , 反離子（－） 如： DEAE纖維素， CMSepharose 離子交換劑 帶有電荷基團(tuán)的 不溶性 載體 OCH2CH2NH CH2CH3 CH2CH3 Cl 載體 Diethylaminoethyl (DEAE) 陰離子交換劑 (可吸附 帶負(fù)電的蛋白質(zhì) ) 陽(yáng)離子