【正文】 ? 一般可在室溫下進(jìn)行。 （二） 有機溶劑沉淀（降低介電常數(shù)） ? 利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。 ?： ? 優(yōu)點 ： 1） 分辨率比鹽析法高 ? 2） 沉淀不需脫鹽 ? 3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心 ? 缺點： 1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活 ? 2)有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。 （ 2） pH 值： 盡可能靠近其等電點。 ?3. 優(yōu)點： ? 1） 大多數(shù)蛋白質(zhì)的 pI都在偏酸性范圍內(nèi) ? 2）無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低 ? 3）無需除掉多余酸即可進(jìn)行下一步純化 ?4. 缺點： ? 酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活 ? （四）有機聚合物沉淀法 1. 作用機理： 與有機溶劑類似 ，是發(fā)展較快的一種新方法。 3. 優(yōu)點： ?① 操作條件溫和 ， 不易引起生物大分子變性 。 ?③ 沉淀后有機聚合物容易去除 。 ? ⑴ 熱變性 ? 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固， 加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。 ? ⑶ 有機溶劑變性 ? 使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。 ?特點： ?1）比化學(xué)沉淀法分離程度高 ?2）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快 ?3）比蒸餾法能耗低 （一）溶劑萃取法 明確幾個概念： 料液： 供提取的溶液。 萃取劑 ： 用來進(jìn)行萃取的溶劑，通常是有機溶劑 。 萃余液： 被萃取出溶質(zhì)后的料液 。 ?溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平衡規(guī)律 ）為基礎(chǔ)。 ? 萃取相濃度 C1 ?分配系數(shù) K0 = —————— = —— ? 萃余相濃度 C2 ? K0值隨溶液 pH的變化甚大，這是用萃取法實現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。 萃取操作的 3個步驟： 1）混合 2）分離 3）溶劑回收 ?單級萃取 ? 使用一個混合器和一個分離器 ? 單級萃取流程 93 （二） 雙水相萃取技術(shù) ? 又稱水溶液兩相分配技術(shù) ? （ partion of two aqueous phase system） ? 用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（ PEG）和葡聚糖（ Dextran）進(jìn)行萃取。 ?優(yōu)點： ?1） 每一水相中均有很高的含水量，為 ?酶等生物物質(zhì)提供了一個良好的環(huán)境； ?2） PEG、 Dextran和無機鹽對酶等無毒 ?害作用，不會引起變性。 a 雙節(jié)線 系線 b 雙節(jié)線 均相區(qū) 均相區(qū) 兩相區(qū) 兩相區(qū) 系線 臨界點 PEG/Dx和 PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖 ? 幾種典型的雙水相系統(tǒng) ? 聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 ? 葡聚糖（ Dex） ? 羥丙基葡聚糖 ? 聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（ Dex） ? 硫酸葡聚糖鈉鹽 聚丙烯乙二醇 ? 羧基甲基葡聚糖鈉鹽 甲基纖維素 ? 聚乙二醇（ PEG） 磷酸鉀、 硫酸銨 ? 硫酸鈉、硫酸鎂 2. 萃取原理： 利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。 ? ? 幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實例 酶 菌 種 相系統(tǒng) ? 延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 鹽 ? 天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 鹽 ??半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 鹽 ? 亮氨酸脫氫酶 Bacillus sp. PEG/Dex ? 乙醇脫氫酶 Baker’ s yeast PEG/ 鹽 ? 青霉素?；? E. coli PEG/ 鹽 雙水相萃取法的重要研究方向 —— 親和萃取（親和分配 ） 使用具有生物特異性的配基（ ligand）來提高分離選擇性。 ? 超臨界流體 (supercritical fluid，SCF） ：超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點 —— 臨界點后的流體 。 ?臨界壓力： 在臨界溫度下，液化氣體所需要的壓力。 ?2) SCF粘度和擴(kuò)散系數(shù)接近于氣體， ? 傳質(zhì)擴(kuò)散快 。 ?2）降低壓力，使 SCF變?yōu)闅鈶B(tài)（密度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃取物與溶劑分離。 反膠團(tuán)模型 親水基團(tuán)向內(nèi)聚集 （正）膠束 反膠束 形成 表面活性劑溶于水，使其濃度超過臨界膠束濃度。 構(gòu)造 表面活性劑極性基團(tuán)在外，非極性基團(tuán)在內(nèi)，形成非極性核心。 功能 溶解非極性物質(zhì) 溶解極性物質(zhì) ? p154 2. 萃取過程 第一步： 將酶從水相中萃取到反膠束相中。 反膠團(tuán)萃取原理 3. 表面活性劑及有機溶劑 ? 反膠團(tuán)萃取與溶劑萃取的不同，是在有機溶劑中加入了少量表面活性劑。 ?特點： 易獲得，強度好；極性基團(tuán)小，形成的反膠團(tuán)空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)入。 ?4. 優(yōu)點 ? 1）萃取率和反萃取率高。 ? 3） 解決胞內(nèi)酶在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活問題。 ? 5）成本低。 一、膜分離 借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)。 材料：纖維素衍生物。 2）透析袋的保存 ： 防腐劑＋冷藏。 A:透析夾， B:透析， C:透析示意圖 （二）加壓膜分離 根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為 ： 截留顆粒 直徑 操作壓力 應(yīng)用 微濾 ~2?m 除菌 超濾 20A ~ ?m ~ 分離病毒及生物大分子 反滲透 20A ~13MPa 純水制備 微濾 (Microfiltration， MF) 一種靜態(tài)過濾，隨過濾時間延長，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞； 無流動操作滲透 液原料液超濾 (ultrafiltration， UF ) 一種動態(tài)過程，由泵提供推動力，在膜表面產(chǎn)生兩個分力：一個是垂直于膜面的方向分力，使水分子透過膜面，另一個是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。 ?超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。 滲透與反滲透 Reverse Osmosis (RO) Nanofiltration (NF) Ultrafiltration (UF) Microfiltration (MF) Membrane Filtration 3. 電場膜分離 （ 1）電滲析： 在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負(fù)電極。 應(yīng)用： 脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。將植物色素溶液通過裝有 CaCO3 吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。 層析法的基本原理 ? 利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。 分配層析 ：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。 凝膠層析 ：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。 紙層析 ：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。 Column Chromatography 層析柱的制備與層析操作 柱層析的設(shè)備 : 層析柱、蠕動泵（恒流泵）、紫外檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。離子交換纖維素需作酸堿處理。 ? 3）平衡： 層析柱使用前，須用 緩沖液 平衡至所需的 pH值和離子強度 。 平衡： 用緩沖液使不被吸附的雜蛋白穿過。 階梯式梯度洗脫：分段地改變緩沖液的 pH或離子強度。 同時進(jìn)行分步收集和檢測。 蛋白 質(zhì) 定量 —— 分光比色 儀 (A280)法 蛋白質(zhì)分子中的 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基 （ 主要是 色氨酸 Trp和酪氨酸 Tyr 的 共軛雙鍵 ） 對紫外光有吸收，以 色氨酸 吸收最強，最大吸收峰為 280nm。 ?吸附作用的強弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。 ? 吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。 但為了便于解吸附，對于極性強的物質(zhì)通常選用極性弱的吸附劑進(jìn)行吸附。 硅膠： 常用的極性吸附介質(zhì)。 吸附原理是 HA的 Ca2+與蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基團(tuán)作用。 選擇： 具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動相。 4. 應(yīng)用 分離純化生物大分子 （二）凝膠過濾層析 凝膠過濾（ gel filtration）又稱分子篩層析（ molecular sieve chromatography）、排阻層析（ exclusion chromatography） ,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的 分子量不同 而進(jìn)行分離的技術(shù)。 Sizeexclusion chromatography 凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù) Kd表示： VeVo Kd=———— Vi Vo—— 外水體積 ，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ ml） Vi—— 內(nèi)水體積 ，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ ml） Ve—— 某組分的洗脫體積 ，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（ ml） 凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰 Ⅰ . Kd=0時 ,即 Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大 ， 不進(jìn)入微孔 ， 最先流出 。 Ⅲ . 其它組分 0Kd1,因分子大小而改變洗脫峰的位置 。 分配系數(shù) Kd的意義： 1) 可定量地衡量各組分的流出順序。 1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（ dextran gel) 商品名 :Sephadex 型號 Sephadex G－ 10至 G200 G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的 10倍。 凝膠型號 顆粒大小/μ m 溶脹體積/(ml/g) 分離范圍（ Mr） Sephadex G10 Sephadex G15 Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G75 Sephadex G100 Sephadex G150 Sephadex G200 4～ 120 4～ 120 50～ 150 50～ 150 40～ 120 40～ 120 40～ 120 40～ 120 2～ 3 ～ 4～ 6 9～ 11 12～ 15 15～ 20 20～ 30 20～ 30 小于 7 102 小于 103 103～ 103 103～ 104 103～ 104 103～ 105 103