【正文】 機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，分為： 常速（低速） 高速 超速 名稱 轉(zhuǎn)速 (r/min) 注意事項(xiàng) 低速離心機(jī) ?8000 常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡 高速離心機(jī) 10000? 25000 冷凍（防止溫度升高）， 離心管的精確平衡 超速離心機(jī) 25000 冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦）， 離心管的精確平衡 離心機(jī)的種類 實(shí)驗(yàn)室離心機(jī) ? 溫度類型： 常溫及冷凍 ? 超速離心機(jī)均為冷凍型。 由于許多生物大分子的 S值很小，所以定義 10 ?13 s 為一個(gè)沉降單位， 1S = 1?10?13 s。 兩者可換算或查測算圖。 RCF = m r （ 2? N/60） 2 /mg= ?105 N2 r 此公式描述了相對(duì)離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用 r平均 代替 r平均 =1/2（ r大 +r小 ） cm 通常： ?低速離心以 每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù) 表示，如： 4000r/min。 （二）酸、堿溶液提取 （三）有機(jī)溶劑提取 四、 離心分離 （ 一） 基本原理 1. 離心力 Fc = m ac ＝ m r ω 2 ＝ m r （ 2? N/60） 2 N為離心機(jī) 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （ r/min ）； Fc通常以相對(duì)離心力 RCF（ relative centrifugal force）表示，即離心力 F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù) g）的多少倍。 ?b. 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的 pH值，溶解度增加。但為防止酶失活， ? 一般 采用低溫下（ 0~10℃ ） 操作。 b. 保持生物活性。 三、酶的提取 (extraction) ? 把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。 ： 利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測定破碎程度。 ? 自溶法（ autolysis） : ? 細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā) ?生溶解的現(xiàn)象。 ? 2）表面活性劑處理： 常用非離子型表面 ?活性劑，如 Triton X100， Tween等。 ?3. 化學(xué)法 應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。 ? 2）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等） ? 平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。 ? 2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。 第一節(jié) 酶的分離 一、發(fā)酵液預(yù)處理 (一 )發(fā)酵液的相對(duì)純化 1. 無機(jī)離子的去除 2. 雜蛋白質(zhì)的去除 3. 色素及其他物質(zhì)的去除 (二）發(fā)酵液的固液分離 1 . 影響發(fā)酵液過濾的因素 ?1）菌種 ?2）培養(yǎng)基組成 2. 提高過濾性能的方法 1）絮凝和凝聚 2）稀釋、加熱 3）加助濾劑， 常用硅藻土等。 ?高度純化 （ fine fractionation） （精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。 第三章 酶的提取與分離純化 ?預(yù)處理 （ pretreatment） ：包括固液分離和細(xì)胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。 ?初步純化 （ rough fractionation） （提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。 ?濃縮與干燥 （ concentration and desiccation）（成品加工） :使酶與溶劑分離的過程。 二、細(xì)胞破碎 （一） 細(xì)胞壁組成 ?細(xì)胞壁的主要成分： ? 細(xì)菌：肽聚糖 (N乙酰萄糖胺， N乙酰胞壁酸 ) ? 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì) ? 真菌 : 多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖） ? 微生物 革蘭氏陽性細(xì)菌 革蘭氏陰性細(xì)菌 放線菌 酵母菌 霉菌 壁厚/nm 15 ~ 50 10 ~ 13 同 G+ 100 ~ 300 100 ~ 250 層次 單層 多層 多層 多層 主要組成 肽聚糖 (40% ~ 90%) 多糖 胞壁酸 蛋白質(zhì) 脂多糖 (1%? 2%) 肽聚糖 (5% ~ 10%) 脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%) 磷脂 蛋白質(zhì) 葡聚糖 (30% ~ 40%) 甘露聚糖 (30%) 幾丁質(zhì) (1% ~ 2%) 蛋白質(zhì) (6% ~ 8%) 脂類 (% ~ %) 多聚糖 (80% ~ 90%) 脂類 蛋白質(zhì) 各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成 細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) 酵母菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) M— 甘露聚糖； P— 磷酸二酯鍵； G— 葡聚糖 （二）細(xì)胞破碎的方法 ? 機(jī)械法 ? 物理法 ? 化學(xué)法 ? 生物法（酶解） ?： ? 1）液體剪切：攪拌、勻漿。 ? ： ? 1）超聲波破碎法。 ? 3）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。 ? 1）有機(jī)溶劑處理： 破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用 ?丙酮、丁醇、氯仿等。 ?（ enzymatic lysis） ： ? 外加酶法： ? 根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿?。 細(xì)胞對(duì)破碎方法的敏感性 ? 細(xì)胞 聲波 機(jī)械 滲透壓 凍融 ? ———————————————————— ? 動(dòng)植物 +++ +++ +++ +++ ? 革蘭氏陰性菌 ++ ++ ++ ++ ? 革蘭氏陽性芽孢菌 ++ + ++ + ? 酵母 + + + + ? 革蘭氏陽性球菌 + + + ? 菌絲 ++ ++ ? 孢子 （三）細(xì)胞破碎確認(rèn) ： 破碎前，用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)； 破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。 ： 測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。 ? 提取目標(biāo)： a. 將 目的酶最大限度地溶解出來。 ? 注意：溫度升高，溶解度加大。 提取原則 ?a. 相似相溶。 提取方法 ： （一）鹽溶液提取 常用稀鹽（常用 NaCl）溶液（鹽溶），對(duì)酶穩(wěn)定性好、溶解度大 ，最常用。 一般用 g（或數(shù)字 ?g）表示。 ?高速離心（超速），常以 相對(duì)離心力 （ RCF）表 示，如： 65000g。 計(jì)算近似RCF的列線圖 2. 沉降系數(shù) :（ sedimentation constant） 指單位離心力下顆粒的沉降速度（ sedimentation velocity） ,用 S表示 。 常用 S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如 16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在 1 ~ 200之間。 ? 使用冷凍離心機(jī)時(shí)提前降溫，預(yù)冷離心頭。 離心的形式 ? 角式及外擺式：外擺式一般為低速， ? 角式由低速到超速均有。 離心機(jī)的大?。郝涞厥郊芭_(tái)式 小臺(tái)式離心機(jī) 離心管 ? 材質(zhì)：玻璃，塑料 ? 強(qiáng)度：和離心速度相配 ? 大小：和轉(zhuǎn)子配套 ? 高速超速管要加蓋 離心機(jī)操作 ? 平衡、定溫、定速、定時(shí)。 特點(diǎn)： 用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 缺點(diǎn)： 1） 分離效果較差， 不能一次得到純顆粒。 3）沉降的顆粒受到擠壓 。 常用的密度梯度溶液是 蔗糖 溶液。 ?適宜分離密度相近而大小不同的固相 物質(zhì) 。 根據(jù) 顆粒的密度不同 而進(jìn)行分離。 常用 氯化銫 （ CsCl）作為梯度介質(zhì)。 ?適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。 ?差速離心 是一種動(dòng)力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。 （四）應(yīng)用 根據(jù)不同離心目的，分為 ?制備性離心： 分離純化和制備 ?分析性離心： 測分子量、沉降系數(shù)、密度、純度 五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同） ?使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀? ?古老、實(shí)用、簡單的初步分離方法 ?在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法： ? ⑴中性鹽沉淀（鹽析法） ? ⑵有機(jī)溶劑沉淀 ? ⑶選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性） ? ⑷等電點(diǎn)沉淀 ? ⑸有機(jī)聚合物沉淀 （一）鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度） 1. 基本原理（鹽溶和鹽析） 向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象： 1) 鹽溶 （ salting in） ： 低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。 蛋白質(zhì)的鹽析 硫酸銨對(duì)馬血紅蛋白的溶解度的影響 離子強(qiáng)度 鹽 析 鹽溶 原因： 高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。 蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域 ?1）中性鹽的選擇 ? 常用（ NH4） 2SO4，其突出優(yōu)點(diǎn)： ? a. 溶解度大 ? b. 分離效果好 ? c. 不易引起變性 ? d. 價(jià)格便宜 ?2. 鹽析用鹽 2) 鹽濃度的表示 用飽和（溶解）度表示 : 溶液中飽和硫酸銨的體積 飽和度＝ 溶液的總體積 3) 調(diào)整鹽濃度的方式 a. 飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液） 適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時(shí)。 按下式計(jì)算，得表中數(shù)據(jù) B(S2S1) W= —————— 1AS2 A,B—— 常數(shù)，與溫度有關(guān)。 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表 鹽析操作 ? 低飽和度： 飽和溶液滴加法。 ? 高飽和度： 固體鹽添加法。 ? 1）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。 ? 3）沉淀再溶解后可用超濾 （ ultrafiltration） 、透析 （ dialysis） 或?qū)游?（ chromatography） 方法脫鹽。 蛋白質(zhì)量 (mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨 飽和度％ 硫酸銨濃度（ %） 枯草桿菌 ?淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線 ?4. 鹽析的影響因素 ?1) 離子強(qiáng)度和種類（介紹鹽析常數(shù)） 蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系： IKSS s ??? 0l o gl o gI：離子強(qiáng)度， I = ∑MZ 2； M：離子濃度（ mol/L）； Z：離子價(jià)數(shù) S：離子強(qiáng)度為 I時(shí)的蛋白質(zhì)的溶解度（ g/L） S0：離子強(qiáng)度為 0時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度（ g/L） Ks：鹽析常數(shù)，是與 蛋白質(zhì) 和 鹽種類 有關(guān)的特性常數(shù)。 當(dāng)溫度一定時(shí) ， S0對(duì)于某一溶質(zhì)是常數(shù) ，用 β 表示 ， 鹽析方程式可改寫為： log S = β Ks I 兩種鹽析法： Ks分級(jí)鹽析法 ： 在一定的 pH和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì) Ks的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變 I值）的沉淀方法。 ?2) 蛋白質(zhì)濃度： ? 過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，%3%最好。 ?4) 溫度的影響： ?稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。