【正文】 ～ 105 103～ 105 葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù) 2）瓊脂糖凝膠（ agarose gel) 商品名 :Sepharose （瑞典） 。 型號(hào) 使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量） 含瓊脂糖（ ℅ ） 6B Sepharose 4B 2B 104～ 3 106 105～ 3 107 106～ 108 6 4 2 6B Sepharose CL 4B 2B 同上 同上 BioGel A 5m 15m 50m 150m 10～ 500 103 10～ 1500 10～ 5000 40～ 15000 100～ 50000 1000～ 150000 10 8 6 4 2 1 Sepharose及 Biogel A 型號(hào) 3）聚丙烯酰胺凝膠 （ polyacrylamide gel） 商品名為 BioGel,型號(hào)從 BioGel P－ 2至 P300， P值越大，孔徑也越大。 3. 操作： 1）凝膠的選擇和處理 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號(hào)的凝膠介質(zhì)。 2）柱的選擇 采用 L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速 。 ? 4）洗脫 ? 洗脫液與平衡時(shí)用的 buffer一致。 ? 5）膠的保存 ? 洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。 4. 應(yīng)用 1）脫鹽 ２ ) 生物大分子物質(zhì)的 分離純化 3）分子量的測(cè)定 4）溶液濃縮 LogM A B C LogM測(cè) V測(cè) LogM=k1k2Ve （ Ve為洗脫體積） 先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的 Ve，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。 1）離子交換劑 ： 離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。 ? DEAE（ QAE） Sephadex A25， A50 CM（ SP） Sephadex C25， C50 A： anion 陰離子 C: cation 陽(yáng)離子 類型 說明 功能基 反離子 DEAESephadex A25 ， A50 弱堿性陰離子交換劑 二乙氨基己基 氯 QAESephadex A25 ， A50 強(qiáng)堿性陰離子交換劑 二乙氨基己基 —— 2羥丙基 氯 CMSephadex C25 ， C50 弱酸性陽(yáng)離子交換劑 羧甲基 鈉 SPSephadex C25 ， C50 強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑 磺丙基 鈉 離子交換葡聚糖 離子交換劑的選擇 a. 強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇： 強(qiáng)型：適用的 pH范圍廣， 制備無離子水 弱型：適用的 pH范圍窄， 分離生物大分子物質(zhì) b. 陰、陽(yáng)離子交換劑的選擇： 酶的穩(wěn)定性 若 pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶正電荷，用陽(yáng)離子交換劑 若 pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑 2） 蛋白 質(zhì) 的 電荷性質(zhì) P rN H 3+C O O HP rN H 3+C O OP rN H 2C O OO HH +O HH +兼 性 離 子p H = p I陽(yáng) 離 子p H p I陰 離 子p H p IpH 值如何影響蛋白質(zhì)的電荷數(shù) 2 4 6 8 10 12 14 0 系統(tǒng) pH + 蛋白質(zhì)帶正電荷 蛋白 質(zhì)帶負(fù)電 荷 等電點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原 理 利用不同的蛋白 質(zhì) 分子在溶液中所 帶電荷 不同，因而 與離子交換劑 有不同吸附力而 分離。 2）洗脫 : 增加溶液的離子強(qiáng)度 梯度洗脫法 改變?nèi)芤旱?pH值 3）再生： 用 合溶液或 。利用疏水層析介質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都具有一定的疏水性質(zhì) ，根據(jù)被分離成分與固定相之間疏水力大小的不同而進(jìn)行分離。 1. 原理 : 在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)發(fā)生局部可逆變性，被迫與疏水層析的固定相結(jié)合在一起，然后通過降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，即可將結(jié)合于固定相的蛋白質(zhì)，按其結(jié)合力大小，依次進(jìn)行解吸附。 2） 洗脫： 用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。 4. 應(yīng)用 主要用于分離純化大分子物質(zhì)。 又稱： 功能層析（ function chromatography） 生物專一吸附（ biospecific adsorption）選擇層析（ selective chromatography） 利用生物大分子間 特異的親和力 來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的 DNA等。 + C C C 配基 蛋白質(zhì) 固體載體 Affinity chromatography 2. 基質(zhì)的選擇 理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求： ① 高度的親水性。 ③ 具有足夠的化學(xué)基團(tuán)。 ⑤ 較好的理化穩(wěn)定性。 最常用的是瓊脂糖， Sepharose 1B到 10B 3. 配體的選擇 一對(duì)可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。 優(yōu)良配體須具備的條件： 1）與待純化的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。 所要分離的目的產(chǎn)物 相應(yīng)的配基 酶 抗體 凝集素 激素 底物、抑制劑、輔酶（輔因子） 抗原、病毒、細(xì)胞 多糖、糖蛋白、細(xì)胞受體 受體、載體蛋白 目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配基 4. 偶聯(lián)（親和吸附劑的制備） 配體一定，改造載體（基質(zhì)） 1）基質(zhì)活化： 不同的載體活化需要不同的活化劑。 溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。 “ 接臂 ” 的途徑： 常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。如：AHSepharose 4B 常用手臂 5. 操作： 1） 層析前： 制備親和層析劑 選擇 根據(jù)欲分離物質(zhì)特性 配基 選擇 根據(jù)配基分子大小及基團(tuán)特性 載體 2）洗脫： 能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。 (六 ) 高效（壓）液相層析 （ HPLC： High Performance（ pressure） Liquid Chromatography ） ?特點(diǎn)： ①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大 ,因而分辨率很高。 固定相（柱填料）： 常用 堅(jiān)硬、耐高壓 ， 粒度小 的硅膠。 洗脫體積（ ml） 1. 基本原理 HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。 2. 分類 按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)分類： 親和色譜： —— 親和力 吸附色譜： —— 吸附力 離子交換色譜： —— 離子交換能力 凝膠色譜 ： —— 分子大小而引起的體積排阻 分配色譜： —— 分配系數(shù) 分配色譜又可分為： 正相色譜： 固定相為極性，流動(dòng)相為非極性。 用的最多，約占 60～ 70％。 流動(dòng)相組成 ：常用 “ 甲醇 — H2O” 。 即：隨著甲醇梯度的增加而洗脫出疏水性越來越強(qiáng)的蛋白質(zhì)。 ? 電泳技術(shù) 是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 。 + 遷移率與 內(nèi)在特性 和 外界條件 有關(guān) 內(nèi)在特性 ：顆粒性質(zhì)（凈電荷量，顆粒大小、形狀） 外界條件 ：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液性質(zhì)、支持體特性 將帶凈電荷 Q的粒子放入電場(chǎng)，受到的電引力為： F引 =EQ 在溶液中 ,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力 F阻 F阻 = 6πrηV 當(dāng) F引 =F阻 時(shí) EQ = 6πrηV EQ V = 6πrη 影響遷移率的因素： 1）顆粒性質(zhì)： Q越大、 r 越小、形狀越接近球形， v 越快。 3）溶液性質(zhì)： ? pH值：離 pI越遠(yuǎn)， v越快。 原因：離子氛（ ionic atmosphere）。 4）電滲： 在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。 ? 自由界面電泳： 又稱移動(dòng)界面電泳 （ moving boundary electrophoresis, MBEP） ，指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。 支持介質(zhì)的作用 :防止電泳過程中的對(duì)流和擴(kuò)散。 ② 醋酸纖維素薄膜電泳 ：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 ③ 瓊脂糖凝膠電泳 ： 一般用于核酸的分離分析。 ④聚丙烯酰胺凝膠電泳 ： 可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。 ?聚丙烯酰胺 和 瓊脂糖 是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。 常壓電泳儀 （ 600V） 高壓電泳儀 （ 3000V） 超高壓電泳儀 （ 30000V～ 50000V） （ 2）電泳槽： 自由界面電泳槽 管狀電泳槽 板狀電泳槽 （ 3） 附屬設(shè)備： 水平板式電泳槽 垂直板式電泳槽 二、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE）是以 聚丙烯酰胺凝膠 作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。 CH2=CH C=O NH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH CH2CH[CH2CH]nCH2CH C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O CH2CH[CH2CH]nCH2CH C=O C=O NH NH2 丙烯酰胺 N,N’ 甲叉雙丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： 1）化學(xué)催化系統(tǒng)： APTEMED 催化劑： 過硫酸銨 （ ammonium persulfate， AP） 加速劑： TEMED（ N， N， N’ ， N’ 四甲基乙二胺） 2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（ TEMED） 催化劑 : 核黃素（維生素 B2） 引發(fā)劑 : 光 TEMED的存在，可加速聚合。 T= C= 凝膠濃度越大（?。讖皆叫。ù螅煞蛛x分子量較?。ù螅┑念w粒 。 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系 Acr（ g） +Bis（ g） V（ ml） X100% Acr（ g） +Bis（ g） Bis（ g） X100% 樣品 分子量（ Da） 適宜的凝膠濃度（％） 蛋白質(zhì)