【正文】 ～ 4～ 6 9～ 11 12～ 15 15～ 20 20～ 30 20～ 30 小于 7 102 小于 103 103～ 103 103～ 104 103～ 104 103～ 105 103～ 105 103～ 105 葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù) 2）瓊脂糖凝膠（ agarose gel) 商品名 :Sepharose （瑞典） 。 ? 4）洗脫 ? 洗脫液與平衡時(shí)用的 buffer一致。 ? DEAE（ QAE） Sephadex A25， A50 CM（ SP） Sephadex C25， C50 A： anion 陰離子 C: cation 陽離子 類型 說明 功能基 反離子 DEAESephadex A25 ， A50 弱堿性陰離子交換劑 二乙氨基己基 氯 QAESephadex A25 ， A50 強(qiáng)堿性陰離子交換劑 二乙氨基己基 —— 2羥丙基 氯 CMSephadex C25 ， C50 弱酸性陽離子交換劑 羧甲基 鈉 SPSephadex C25 ， C50 強(qiáng)酸性陽離子交換劑 磺丙基 鈉 離子交換葡聚糖 離子交換劑的選擇 a. 強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇： 強(qiáng)型：適用的 pH范圍廣， 制備無離子水 弱型：適用的 pH范圍窄， 分離生物大分子物質(zhì) b. 陰、陽離子交換劑的選擇： 酶的穩(wěn)定性 若 pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶正電荷，用陽離子交換劑 若 pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑 2） 蛋白 質(zhì) 的 電荷性質(zhì) P rN H 3+C O O HP rN H 3+C O OP rN H 2C O OO HH +O HH +兼 性 離 子p H = p I陽 離 子p H p I陰 離 子p H p IpH 值如何影響蛋白質(zhì)的電荷數(shù) 2 4 6 8 10 12 14 0 系統(tǒng) pH + 蛋白質(zhì)帶正電荷 蛋白 質(zhì)帶負(fù)電 荷 等電點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原 理 利用不同的蛋白 質(zhì) 分子在溶液中所 帶電荷 不同，因而 與離子交換劑 有不同吸附力而 分離。 2） 洗脫： 用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。 ③ 具有足夠的化學(xué)基團(tuán)。 所要分離的目的產(chǎn)物 相應(yīng)的配基 酶 抗體 凝集素 激素 底物、抑制劑、輔酶（輔因子） 抗原、病毒、細(xì)胞 多糖、糖蛋白、細(xì)胞受體 受體、載體蛋白 目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配基 4. 偶聯(lián)（親和吸附劑的制備） 配體一定，改造載體（基質(zhì)） 1）基質(zhì)活化： 不同的載體活化需要不同的活化劑。 (六 ) 高效（壓）液相層析 （ HPLC： High Performance（ pressure） Liquid Chromatography ） ?特點(diǎn)： ①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大 ,因而分辨率很高。 用的最多，約占 60～ 70％。 + 遷移率與 內(nèi)在特性 和 外界條件 有關(guān) 內(nèi)在特性 ：顆粒性質(zhì)（凈電荷量，顆粒大小、形狀） 外界條件 ：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液性質(zhì)、支持體特性 將帶凈電荷 Q的粒子放入電場(chǎng)，受到的電引力為： F引 =EQ 在溶液中 ,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力 F阻 F阻 = 6πrηV 當(dāng) F引 =F阻 時(shí) EQ = 6πrηV EQ V = 6πrη 影響遷移率的因素： 1）顆粒性質(zhì)： Q越大、 r 越小、形狀越接近球形， v 越快。 ? 自由界面電泳： 又稱移動(dòng)界面電泳 （ moving boundary electrophoresis, MBEP） ，指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。 ④聚丙烯酰胺凝膠電泳 ： 可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。 T= C= 凝膠濃度越大（小），孔徑越?。ù螅?，可分離分子量較小（大）的顆粒 。 常壓電泳儀 （ 600V） 高壓電泳儀 （ 3000V） 超高壓電泳儀 （ 30000V～ 50000V） （ 2）電泳槽： 自由界面電泳槽 管狀電泳槽 板狀電泳槽 （ 3） 附屬設(shè)備： 水平板式電泳槽 垂直板式電泳槽 二、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE）是以 聚丙烯酰胺凝膠 作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。 ② 醋酸纖維素薄膜電泳 ：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 原因：離子氛（ ionic atmosphere）。 即：隨著甲醇梯度的增加而洗脫出疏水性越來越強(qiáng)的蛋白質(zhì)。 洗脫體積（ ml） 1. 基本原理 HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。 “ 接臂 ” 的途徑： 常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 最常用的是瓊脂糖， Sepharose 1B到 10B 3. 配體的選擇 一對(duì)可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。 又稱： 功能層析（ function chromatography） 生物專一吸附（ biospecific adsorption）選擇層析（ selective chromatography） 利用生物大分子間 特異的親和力 來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的 DNA等。利用疏水層析介質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都具有一定的疏水性質(zhì) ，根據(jù)被分離成分與固定相之間疏水力大小的不同而進(jìn)行分離。 4. 應(yīng)用 1）脫鹽 ２ ) 生物大分子物質(zhì)的 分離純化 3）分子量的測(cè)定 4）溶液濃縮 LogM A B C LogM測(cè) V測(cè) LogM=k1k2Ve （ Ve為洗脫體積） 先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的 Ve，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。 3. 操作： 1）凝膠的選擇和處理 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號(hào)的凝膠介質(zhì)。 分配系數(shù) Kd的意義： 1) 可定量地衡量各組分的流出順序。 選擇： 具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動(dòng)相。 ? 吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。 階梯式梯度洗脫：分段地改變緩沖液的 pH或離子強(qiáng)度。 Column Chromatography 層析柱的制備與層析操作 柱層析的設(shè)備 : 層析柱、蠕動(dòng)泵（恒流泵）、紫外檢測(cè)儀、部分收集器、梯度洗脫器。 層析法的基本原理 ? 利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動(dòng)相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。 ?超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。 一、膜分離 借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)。 ?特點(diǎn)： 易獲得，強(qiáng)度好；極性基團(tuán)小，形成的反膠團(tuán)空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)入。 反膠團(tuán)模型 親水基團(tuán)向內(nèi)聚集 （正）膠束 反膠束 形成 表面活性劑溶于水，使其濃度超過臨界膠束濃度。 ? 超臨界流體 (supercritical fluid，SCF） ：超過氣液共存時(shí)的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點(diǎn) —— 臨界點(diǎn)后的流體 。 萃取操作的 3個(gè)步驟： 1）混合 2）分離 3）溶劑回收 ?單級(jí)萃取 ? 使用一個(gè)混合器和一個(gè)分離器 ? 單級(jí)萃取流程 93 （二） 雙水相萃取技術(shù) ? 又稱水溶液兩相分配技術(shù) ? （ partion of two aqueous phase system） ? 用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（ PEG）和葡聚糖（ Dextran）進(jìn)行萃取。 萃取劑 ： 用來進(jìn)行萃取的溶劑，通常是有機(jī)溶劑 。 ?③ 沉淀后有機(jī)聚合物容易去除 。 ?： ? 優(yōu)點(diǎn) ： 1） 分辨率比鹽析法高 ? 2） 沉淀不需脫鹽 ? 3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心 ? 缺點(diǎn)： 1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活 ? 2)有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求較高。 ?2) 蛋白質(zhì)濃度： ? 過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，%3%最好。 ? 1）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。 蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域 ?1）中性鹽的選擇 ? 常用（ NH4） 2SO4，其突出優(yōu)點(diǎn)： ? a. 溶解度大 ? b. 分離效果好 ? c. 不易引起變性 ? d. 價(jià)格便宜 ?2. 鹽析用鹽 2) 鹽濃度的表示 用飽和（溶解）度表示 : 溶液中飽和硫酸銨的體積 飽和度＝ 溶液的總體積 3) 調(diào)整鹽濃度的方式 a. 飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液） 適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時(shí)。 ?適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。 常用的密度梯度溶液是 蔗糖 溶液。 離心機(jī)的大?。郝涞厥郊芭_(tái)式 小臺(tái)式離心機(jī) 離心管 ? 材質(zhì)：玻璃，塑料 ? 強(qiáng)度：和離心速度相配 ? 大?。汉娃D(zhuǎn)子配套 ? 高速超速管要加蓋 離心機(jī)操作 ? 平衡、定溫、定速、定時(shí)。 計(jì)算近似RCF的列線圖 2. 沉降系數(shù) :（ sedimentation constant） 指單位離心力下顆粒的沉降速度（ sedimentation velocity） ,用 S表示 。 提取原則 ?a. 相似相溶。 細(xì)胞對(duì)破碎方法的敏感性 ? 細(xì)胞 聲波 機(jī)械 滲透壓 凍融 ? ———————————————————— ? 動(dòng)植物 +++ +++ +++ +++ ? 革蘭氏陰性菌 ++ ++ ++ ++ ? 革蘭氏陽性芽孢菌 ++ + ++ + ? 酵母 + + + + ? 革蘭氏陽性球菌 + + + ? 菌絲 ++ ++ ? 孢子 （三）細(xì)胞破碎確認(rèn) ： 破碎前，用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)； 破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。 ? ： ? 1）超聲波破碎法。 第三章 酶的提取與分離純化 ?預(yù)處理 （ pretreatment） ：包括固液分離和細(xì)胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物