【正文】 ）等。 ? 2）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等） ? 平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。 ： 利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測(cè)定破碎程度。 ?b. 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的 pH值，溶解度增加。 由于許多生物大分子的 S值很小，所以定義 10 ?13 s 為一個(gè)沉降單位， 1S = 1?10?13 s。 （三）常用離心方法 差速離心法 沉降速度法 密度梯度離心 沉降平衡法 等密度梯度離心 1．差速離心 （ differential centrifugation） 采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法 。 特點(diǎn)： ?區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì) 顆粒的密度。 等密度梯度離心示意圖 （ a）離心前； （ b）離心后 密度梯度離心 等密度梯度離心 梯度介質(zhì) 通常用蔗糖 最大的梯度密度 最小密度的沉降樣品 通常用 CsCl 最大的梯度密度 密度最大的沉降樣品 離心條件 在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時(shí)間，低速度 使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長(zhǎng)時(shí)間，高速度 分離依據(jù) 密度相近，但沉降系數(shù)不同 沉降系數(shù)相近，但密度不同 沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn) 總結(jié) ： ?等密度梯度離心 是一種測(cè)定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。 配制飽和硫酸銨溶液 所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計(jì)算： S2S1 V=V0———— 1S2 式中 V,V0—— 分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積 S2,S1—— 分別為所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原來(lái)溶液的硫酸銨飽和度 b. 添加固體硫酸銨 適用于：蛋白質(zhì)溶液原來(lái)體積已經(jīng)很大，而要達(dá)到的鹽濃度又很高時(shí)。 ? 2）冰箱中（ 4℃ ）放置過(guò)夜，待沉淀完全后高速離心。 ?3) pH值： 等電點(diǎn)處最易沉淀。 ? ?4. 影響有機(jī)溶劑沉淀的因素 （ 1）溫度 ： 低溫（ 0℃ ）操作。 ?（五）選擇性變性沉淀法 ? 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。 萃取液 ： 經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與 萃取劑形成的溶液 。由于形成的兩相均有很高的含水量（達(dá) 70%?90%），故稱 “ 雙水相 ” 系統(tǒng)。 臨界點(diǎn)的概念 可用臨界溫度和臨界壓力解釋： ?臨界溫度： 高于此溫度時(shí)，無(wú)論加壓多大也不能使氣體液化。 表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超過(guò)臨界膠束濃度。 ?（ 2） 非極性有機(jī)溶劑 環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。 （一） 擴(kuò)散膜分離 —— 透析 （ dialysis） 溶質(zhì)分子 Y 從高濃度一側(cè)通過(guò)膜向低濃度一側(cè)移動(dòng) 蛋白質(zhì)透析 1. 透析膜 商品透析膜大多制成管狀 。 常規(guī)過(guò)濾 (A)和超濾 (B)的示意圖 A B 圖 461 超濾濃縮裝置 反滲透 （ Reverse osmosis， RO） π半透膜圖14 3 利用反滲透膜選擇性地只能透過(guò)溶劑 (通常是水 )的性質(zhì)，對(duì)溶液施加壓力，使溶劑通過(guò)反滲透膜而從溶液中分離出來(lái)的過(guò)程。 ? mobile phase：攜帶樣品流過(guò)整個(gè)系統(tǒng)的流體 stationary phase：靜止不動(dòng)的一相 層析法的分類 流動(dòng)相有兩種狀態(tài)： *液體作為流動(dòng)相 *氣體作為流動(dòng)相 固定相也有兩種狀態(tài)： *固體吸附劑作為固定相 *以吸附在固體上的液體作為固定相 ? 按兩相所處的狀態(tài)分類： 液相層析 液 固層析 液 液層析 氣相層析 氣 固層析 氣 液層析 ? 按層析過(guò)程的機(jī)理分類： 吸附層析 ：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異。 層析設(shè)備 ? 層析裝置： ? 梯度混和器 ? 蠕動(dòng)泵 ? 層析柱 ? 監(jiān)測(cè)儀 ? 記錄儀 ? 收集器 記錄儀 低溫層析柜 層析操作 ?分離前： ? 1）樹(shù)脂預(yù)處理： 凝膠溶漲。 等溫平衡洗脫：用平衡緩沖液直接進(jìn)行擴(kuò)展洗脫。 ? 1）吸附劑的選擇： ? 根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為： ? 弱吸附劑：蔗糖、淀粉 ? 中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等 ? 強(qiáng)吸附劑：氧化鋁、活性炭 吸附劑的選擇根據(jù)相似相溶原則： ?極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì) ?非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。 生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。 2) 判斷分離效果， Kd差異大，分離效果好， Kd差異小，分離效果差。 將干膠懸浮于 5~10倍的 蒸餾水中 ，充分溶脹，抽氣，裝柱。 蛋白質(zhì)的洗脫體積與其分子量有關(guān) （三）離子交換層析 （ ion exchange chromatography， IEC） :根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離 純化方法。 大多數(shù)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性，但分子內(nèi)部存在一個(gè)疏水核心， 欲讓蛋白質(zhì)與疏水性固定相結(jié)合在一起，可以靠蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)丁（ hydrophobic patch），或讓蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性（可逆），暴露出掩藏于分子內(nèi)的疏水性殘基。 ? 將待純化物質(zhì)的特異配體通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附， 從層析柱流出， 變換洗脫條件，即可將 欲分離的物質(zhì)洗 脫下來(lái) ，實(shí)現(xiàn)分離提純。 如抑制劑，底物，抗體，輔酶等。 目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應(yīng)。 許多類型的柱層析都可用 HPLC來(lái)代替，如離子交換層析、吸附層析、凝膠過(guò)濾等。 3. 色譜儀組成 1）進(jìn)樣系統(tǒng) 2）輸液系統(tǒng) 3）分離系統(tǒng) 4）檢測(cè)系統(tǒng) 5）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) Principles of Operation for Chromatography Techniques Gel Filtration Ion Exchange Hydrophobic Interaction Affinity Reversed Phase 銜接層析技術(shù)時(shí)注意事項(xiàng) 層析技術(shù) 結(jié)束情況 起始條件 小量樣品 GF 低離子強(qiáng)度 IEX 高離子強(qiáng)度或 pH 改變 高離子強(qiáng)度 HIC 低離子強(qiáng)度 特異性結(jié)合 AC 特異性洗脫 樣品稀釋，緩沖液不變 第三節(jié) 電泳 ? 電泳 （ electrophoresis, EP） ： ? 指帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)的過(guò)程。 通常，緩沖液離子強(qiáng)度在 。 ?以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。 聚丙烯酰胺凝膠是由 丙烯酰胺單體（ acrylamide，簡(jiǎn)稱 Acr）和交聯(lián)劑 N， N’ 甲叉雙丙烯酰胺 （ methylane bisacrylamide，簡(jiǎn)稱 Bis）在 催化劑 和 加速劑 作用下聚合的。 . 聚丙烯酰胺凝膠： 丙烯酰胺＋ N,N’ －甲叉雙丙烯酰胺聚合而成 凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性和透明度粘著度取決于凝膠總濃度（ T） 和交聯(lián)度（ C）。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。 應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。 一、電泳的基本理論 1. 原理 : ? 在一定 pH條件下（用 buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。 反相色譜： 固定相為非極性，流動(dòng)相為極性。 包括：非專一性洗脫和專一性洗脫 偶聯(lián) 親和層析劑 非專一性洗脫： 改變溫度 改變 pH值 改變離子強(qiáng)度 專一性洗脫： 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑（半抗原、抑制 劑、底物類似物） 被吸附物質(zhì)結(jié)合 競(jìng)爭(zhēng)性地與 配體結(jié)合 6. 應(yīng)用 1）純化大分子物質(zhì) 如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)）， LectinSepharose 4B 2) 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能： 分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。 2）具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)。 ② 極低的非特異性吸附性（惰性）。 2. 吸附劑 親水性（如 Sepharose） 基質(zhì) 固定相 疏水性（如硅膠、樹(shù)脂） 配體 （疏水性基團(tuán)）（苯基、辛基、烷基） 產(chǎn)品名稱 載體 配基 生產(chǎn)公司 苯基 Sepharose 4B 瓊脂糖凝膠珠 苯基 Pharnacia 辛基 Sepharose 4B 瓊脂糖凝膠珠 辛基 Pharnacia 烷基交聯(lián)瓊脂糖凝膠珠 瓊脂糖凝膠珠 烷基(Cn) 以 色 列 一些商品疏水層析介質(zhì) 3. 操作 1） 加樣： 樣品溶液中補(bǔ)加適量的鹽。 如羧甲基纖維素離子交換劑組成 纖維素 — O— CH2— COO— Na+ 載體 電荷基團(tuán) 反離子 化學(xué)原料合成 ：樹(shù)脂類物質(zhì) 載體 天然材料制成： cellulose sephadex sepharose 陽(yáng)離子交換劑 : 電荷基團(tuán)（－） , 反離子（＋） 電荷基團(tuán) 陰離子交換劑 : 電荷基團(tuán)（＋） , 反離子（－） 如： DEAE纖維素， CMSepharose 離子交換劑 帶有電荷基團(tuán)的 不溶性 載體 OCH2CH2NH CH2CH3 CH2CH3 Cl 載體 Diethylaminoethyl (DEAE) 陰離子交換劑 (可吸附 帶負(fù)電的蛋白質(zhì) ) 陽(yáng)離子交換劑 (可吸附 帶正電的蛋白質(zhì) ) 兩種離子交換劑 ? 陰離子交換劑： ? 常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基 2羥丙基 ? 陽(yáng)離子交換劑： ? 常用羧甲基 CM — CH2COO－ ? 磺丙基 SP — C3H6SO3－ DEAE － C2H4N+(C2H5)2H QAE － C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 離子交換葡聚糖 ? 以 Sephadex G25, G50為骨架，接入離子交換基團(tuán)。 ? 3）加樣 ? 體積不能過(guò)多，不超過(guò)床體積的 5％，脫鹽時(shí)可在 10％左右。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。 1. 基本原理 大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來(lái)； 小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長(zhǎng)而后流出層析柱。 2）吸附劑的性質(zhì)： 活性炭： 常用的吸附介質(zhì)。 分離后： 再生，平衡，保存。 ? 2）裝柱： 重力沉降法，要求 均勻，無(wú)氣泡。 離子交換層析 ：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同