【正文】 。（ 2）離子交換膜電滲析： 用離子交換膜代替一般的半透膜。 1）透析膜的預(yù)處理： 目的： 除雜質(zhì)。 ? 2）分離濃縮同時(shí)進(jìn)行，溶劑可反復(fù)利用。 表面活性劑非極性基團(tuán)在外，極性基團(tuán)在內(nèi)，形成極性核心，溶于水后，形成水池（ water pool ）。 ? ?SCF性質(zhì) 介于液體和氣體之間 ： ?1) SCF密度接近于液體，溶解度高。 ： 兩種不同水溶性聚合物濃度達(dá)到一定值時(shí)，體系會(huì)自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。 反萃?。?back extraction）： 完成萃取操作后， 將產(chǎn)物從有機(jī)相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。 ? ⑵ pH變性 ? 等電點(diǎn)沉淀法是 pH變性法中的一種變體。 （ 3）離子強(qiáng)度： 采用 增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度 目的 防止蛋白質(zhì)變性 （ 4）蛋白質(zhì)濃度： 適當(dāng)，一般為 5? 20mg/ml （三） 等電點(diǎn)沉淀 (isoelectric precipitation) ? ? 蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低 ? 不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn) ? 2. 使用方法 ? 單獨(dú) 使用 較少 （ 用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白 ） ， 多與其它方法聯(lián)合使用（ 如鹽析法 、 有機(jī)溶劑法 ） ， 因 蛋白質(zhì) 在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度 。 ?濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。 3. 鹽析曲線的制作 ? 如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。 實(shí)際使用時(shí)，可直接查表 （各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。 ?密度梯度離心 兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。 密度梯度離心示意圖 （ a）離心前 （ b）離心后 Density gradient ultracentrifugation 密度梯度離心 步驟： B. 加樣 3. 等密度梯度離心 又稱 沉降平衡離心 （ sedimentation equilibrium centrifugation）。 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)單 。 （二）離心機(jī)的種類 按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，分為： 常速（低速） 高速 超速 名稱 轉(zhuǎn)速 (r/min) 注意事項(xiàng) 低速離心機(jī) ?8000 常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡 高速離心機(jī) 10000? 25000 冷凍（防止溫度升高）， 離心管的精確平衡 超速離心機(jī) 25000 冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦）， 離心管的精確平衡 離心機(jī)的種類 實(shí)驗(yàn)室離心機(jī) ? 溫度類型： 常溫及冷凍 ? 超速離心機(jī)均為冷凍型。 （二）酸、堿溶液提取 （三）有機(jī)溶劑提取 四、 離心分離 （ 一） 基本原理 1. 離心力 Fc = m ac ＝ m r ω 2 ＝ m r （ 2? N/60） 2 N為離心機(jī) 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （ r/min ）； Fc通常以相對(duì)離心力 RCF（ relative centrifugal force）表示，即離心力 F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù) g）的多少倍。 三、酶的提取 (extraction) ? 把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。 ?3. 化學(xué)法 應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。 ?高度純化 （ fine fractionation） （精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。 二、細(xì)胞破碎 （一） 細(xì)胞壁組成 ?細(xì)胞壁的主要成分： ? 細(xì)菌：肽聚糖 (N乙酰萄糖胺， N乙酰胞壁酸 ) ? 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì) ? 真菌 : 多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖） ? 微生物 革蘭氏陽性細(xì)菌 革蘭氏陰性細(xì)菌 放線菌 酵母菌 霉菌 壁厚/nm 15 ~ 50 10 ~ 13 同 G+ 100 ~ 300 100 ~ 250 層次 單層 多層 多層 多層 主要組成 肽聚糖 (40% ~ 90%) 多糖 胞壁酸 蛋白質(zhì) 脂多糖 (1%? 2%) 肽聚糖 (5% ~ 10%) 脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%) 磷脂 蛋白質(zhì) 葡聚糖 (30% ~ 40%) 甘露聚糖 (30%) 幾丁質(zhì) (1% ~ 2%) 蛋白質(zhì) (6% ~ 8%) 脂類 (% ~ %) 多聚糖 (80% ~ 90%) 脂類 蛋白質(zhì) 各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成 細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) 酵母菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) M— 甘露聚糖； P— 磷酸二酯鍵； G— 葡聚糖 （二）細(xì)胞破碎的方法 ? 機(jī)械法 ? 物理法 ? 化學(xué)法 ? 生物法（酶解） ?： ? 1）液體剪切：攪拌、勻漿。 ?（ enzymatic lysis） ： ? 外加酶法： ? 根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿?。 ? 注意：溫度升高，溶解度加大。 ?高速離心（超速），常以 相對(duì)離心力 （ RCF）表 示，如： 65000g。 離心的形式 ? 角式及外擺式：外擺式一般為低速， ? 角式由低速到超速均有。 3）沉降的顆粒受到擠壓 。 常用 氯化銫 （ CsCl）作為梯度介質(zhì)。 蛋白質(zhì)的鹽析 硫酸銨對(duì)馬血紅蛋白的溶解度的影響 離子強(qiáng)度 鹽 析 鹽溶 原因： 高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。 ? 高飽和度： 固體鹽添加法。 當(dāng)溫度一定時(shí) ， S0對(duì)于某一溶質(zhì)是常數(shù) ，用 β 表示 ， 鹽析方程式可改寫為： log S = β Ks I 兩種鹽析法： Ks分級(jí)鹽析法 ： 在一定的 pH和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì) Ks的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變 I值）的沉淀方法。 （二） 有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)） ? 利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。 3. 優(yōu)點(diǎn)： ?① 操作條件溫和 ， 不易引起生物大分子變性 。 ?特點(diǎn)： ?1）比化學(xué)沉淀法分離程度高 ?2）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快 ?3）比蒸餾法能耗低 （一）溶劑萃取法 明確幾個(gè)概念： 料液： 供提取的溶液。 ? 萃取相濃度 C1 ?分配系數(shù) K0 = —————— = —— ? 萃余相濃度 C2 ? K0值隨溶液 pH的變化甚大，這是用萃取法實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。 ? ? 幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實(shí)例 酶 菌 種 相系統(tǒng) ? 延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 鹽 ? 天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 鹽 ??半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 鹽 ? 亮氨酸脫氫酶 Bacillus sp. PEG/Dex ? 乙醇脫氫酶 Baker’ s yeast PEG/ 鹽 ? 青霉素?；? E. coli PEG/ 鹽 雙水相萃取法的重要研究方向 —— 親和萃?。ㄓH和分配 ） 使用具有生物特異性的配基（ ligand）來提高分離選擇性。 ?2）降低壓力，使 SCF變?yōu)闅鈶B(tài)（密度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃取物與溶劑分離。 反膠團(tuán)萃取原理 3. 表面活性劑及有機(jī)溶劑 ? 反膠團(tuán)萃取與溶劑萃取的不同，是在有機(jī)溶劑中加入了少量表面活性劑。 ? 5）成本低。 A:透析夾， B:透析， C:透析示意圖 （二）加壓膜分離 根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為 ： 截留顆粒 直徑 操作壓力 應(yīng)用 微濾 ~2?m 除菌 超濾 20A ~ ?m ~ 分離病毒及生物大分子 反滲透 20A ~13MPa 純水制備 微濾 (Microfiltration， MF) 一種靜態(tài)過濾，隨過濾時(shí)間延長(zhǎng)，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞； 無流動(dòng)操作滲透 液原料液超濾 (ultrafiltration， UF ) 一種動(dòng)態(tài)過程，由泵提供推動(dòng)力，在膜表面產(chǎn)生兩個(gè)分力：一個(gè)是垂直于膜面的方向分力，使水分子透過膜面，另一個(gè)是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。將植物色素溶液通過裝有 CaCO3 吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開。 紙層析 ：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。 平衡： 用緩沖液使不被吸附的雜蛋白穿過。 ?吸附作用的強(qiáng)弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。 吸附原理是 HA的 Ca2+與蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基團(tuán)作用。 Ⅲ . 其它組分 0Kd1,因分子大小而改變洗脫峰的位置 。 型號(hào) 使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量） 含瓊脂糖（ ℅ ） 6B Sepharose 4B 2B 104～ 3 106 105～ 3 107 106～ 108 6 4 2 6B Sepharose CL 4B 2B 同上 同上 BioGel A 5m 15m 50m 150m 10～ 500 103 10～ 1500 10～ 5000 40～ 15000 100～ 50000 1000～ 150000 10 8 6 4 2 1 Sepharose及 Biogel A 型號(hào) 3）聚丙烯酰胺凝膠 （ polyacrylamide gel） 商品名為 BioGel,型號(hào)從 BioGel P－ 2至 P300， P值越大，孔徑也越大。 ? 5）膠的保存 ? 洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。 2）洗脫 : 增加溶液的離子強(qiáng)度 梯度洗脫法 改變?nèi)芤旱?pH值 3）再生： 用 合溶液或 。 4. 應(yīng)用 主要用于分離純化大分子物質(zhì)。 ⑤ 較好的理化穩(wěn)定性。 溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。 固定相（柱填料）： 常用 堅(jiān)硬、耐高壓 ， 粒度小 的硅膠。 流動(dòng)相組成 ：常用 “ 甲醇 — H2O” 。 3）溶液性質(zhì)： ? pH值：離 pI越遠(yuǎn)， v越快。 支持介質(zhì)的作用 :防止電泳過程中的對(duì)流和擴(kuò)散。 ?聚丙烯酰胺 和 瓊脂糖 是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系 Acr（ g） +Bis（ g） V（ ml） X100% Acr（ g） +Bis（ g） Bis（ g） X100% 樣品 分子量（ Da） 適宜的凝膠濃度（％） 蛋白質(zhì)