【正文】 術(shù) ? （ partion of two aqueous phase system） ? 用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（ PEG）和葡聚糖（ Dextran）進行萃取。 ?溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平衡規(guī)律 ）為基礎(chǔ)。 萃取劑 ： 用來進行萃取的溶劑，通常是有機溶劑 。 ? ⑶ 有機溶劑變性 ? 使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。 ?③ 沉淀后有機聚合物容易去除 。 ?3. 優(yōu)點： ? 1） 大多數(shù)蛋白質(zhì)的 pI都在偏酸性范圍內(nèi) ? 2）無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低 ? 3）無需除掉多余酸即可進行下一步純化 ?4. 缺點： ? 酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活 ? （四）有機聚合物沉淀法 1. 作用機理： 與有機溶劑類似 ，是發(fā)展較快的一種新方法。 ?： ? 優(yōu)點 ： 1） 分辨率比鹽析法高 ? 2） 沉淀不需脫鹽 ? 3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心 ? 缺點： 1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活 ? 2)有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。 ? 一般可在室溫下進行。 ?2) 蛋白質(zhì)濃度： ? 過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，%3%最好。 蛋白質(zhì)量 (mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨 飽和度％ 硫酸銨濃度（ %） 枯草桿菌 ?淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線 ?4. 鹽析的影響因素 ?1) 離子強度和種類（介紹鹽析常數(shù)） 蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系： IKSS s ??? 0l o gl o gI：離子強度， I = ∑MZ 2； M：離子濃度（ mol/L）； Z：離子價數(shù) S：離子強度為 I時的蛋白質(zhì)的溶解度（ g/L） S0：離子強度為 0時蛋白質(zhì)的溶解度（ g/L） Ks：鹽析常數(shù)，是與 蛋白質(zhì) 和 鹽種類 有關(guān)的特性常數(shù)。 ? 1）固體硫酸銨充分研細，溫和攪拌中緩慢加入。 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表 鹽析操作 ? 低飽和度： 飽和溶液滴加法。 蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域 ?1）中性鹽的選擇 ? 常用（ NH4） 2SO4，其突出優(yōu)點： ? a. 溶解度大 ? b. 分離效果好 ? c. 不易引起變性 ? d. 價格便宜 ?2. 鹽析用鹽 2) 鹽濃度的表示 用飽和（溶解）度表示 : 溶液中飽和硫酸銨的體積 飽和度＝ 溶液的總體積 3) 調(diào)整鹽濃度的方式 a. 飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液） 適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達到的鹽濃度又不太高時。 （四）應(yīng)用 根據(jù)不同離心目的，分為 ?制備性離心： 分離純化和制備 ?分析性離心： 測分子量、沉降系數(shù)、密度、純度 五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同） ?使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀? ?古老、實用、簡單的初步分離方法 ?在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法： ? ⑴中性鹽沉淀（鹽析法） ? ⑵有機溶劑沉淀 ? ⑶選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性） ? ⑷等電點沉淀 ? ⑸有機聚合物沉淀 （一）鹽析沉淀法（改變離子強度） 1. 基本原理（鹽溶和鹽析） 向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象： 1) 鹽溶 （ salting in） ： 低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。 ?適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。 根據(jù) 顆粒的密度不同 而進行分離。 常用的密度梯度溶液是 蔗糖 溶液。 缺點： 1） 分離效果較差， 不能一次得到純顆粒。 離心機的大?。郝涞厥郊芭_式 小臺式離心機 離心管 ? 材質(zhì)：玻璃，塑料 ? 強度：和離心速度相配 ? 大?。汉娃D(zhuǎn)子配套 ? 高速超速管要加蓋 離心機操作 ? 平衡、定溫、定速、定時。 ? 使用冷凍離心機時提前降溫，預(yù)冷離心頭。 計算近似RCF的列線圖 2. 沉降系數(shù) :（ sedimentation constant） 指單位離心力下顆粒的沉降速度（ sedimentation velocity） ,用 S表示 。 一般用 g（或數(shù)字 ?g）表示。 提取原則 ?a. 相似相溶。 ? 提取目標(biāo)： a. 將 目的酶最大限度地溶解出來。 細胞對破碎方法的敏感性 ? 細胞 聲波 機械 滲透壓 凍融 ? ———————————————————— ? 動植物 +++ +++ +++ +++ ? 革蘭氏陰性菌 ++ ++ ++ ++ ? 革蘭氏陽性芽孢菌 ++ + ++ + ? 酵母 + + + + ? 革蘭氏陽性球菌 + + + ? 菌絲 ++ ++ ? 孢子 （三）細胞破碎確認(rèn) ： 破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器直接計數(shù)； 破碎后，用染色法區(qū)分破碎細胞與完整細胞。 ? 1）有機溶劑處理： 破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用 ?丙酮、丁醇、氯仿等。 ? ： ? 1）超聲波破碎法。 ?濃縮與干燥 （ concentration and desiccation）（成品加工） :使酶與溶劑分離的過程。 第三章 酶的提取與分離純化 ?預(yù)處理 （ pretreatment） ：包括固液分離和細胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。 第一節(jié) 酶的分離 一、發(fā)酵液預(yù)處理 (一 )發(fā)酵液的相對純化 1. 無機離子的去除 2. 雜蛋白質(zhì)的去除 3. 色素及其他物質(zhì)的去除 (二）發(fā)酵液的固液分離 1 . 影響發(fā)酵液過濾的因素 ?1）菌種 ?2）培養(yǎng)基組成 2. 提高過濾性能的方法 1）絮凝和凝聚 2）稀釋、加熱 3）加助濾劑， 常用硅藻土等。 ? 2）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等） ? 平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。 ? 2）表面活性劑處理： 常用非離子型表面 ?活性劑，如 Triton X100， Tween等。 ： 利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測定破碎程度。 b. 保持生物活性。 ?b. 遠離等電點的 pH值，溶解度增加。 RCF = m r （ 2? N/60） 2 /mg= ?105 N2 r 此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用 r平均 代替 r平均 =1/2（ r大 +r小 ） cm 通常： ?低速離心以 每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù) 表示，如： 4000r/min。 由于許多生物大分子的 S值很小，所以定義 10 ?13 s 為一個沉降單位， 1S = 1?10?13 s。 ? 使用超速離心機時先抽真空。 （三）常用離心方法 差速離心法 沉降速度法 密度梯度離心 沉降平衡法 等密度梯度離心 1．差速離心 （ differential centrifugation） 采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法 。 2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。 特點： ?區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì) 顆粒的密度。 離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，達到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。 等密度梯度離心示意圖 （ a）離心前； （ b）離心后 密度梯度離心 等密度梯度離心 梯度介質(zhì) 通常用蔗糖 最大的梯度密度 最小密度的沉降樣品 通常用 CsCl 最大的梯度密度 密度最大的沉降樣品 離心條件 在最前的沉降物質(zhì)達到管底前停止，短時間，低速度 使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時間，高速度 分離依據(jù) 密度相近，但沉降系數(shù)不同 沉降系數(shù)相近，但密度不同 沉降速度離心和沉降平衡離心的特點 總結(jié) ： ?等密度梯度離心 是一種測定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。 2) 鹽析 （ salting out） ： 高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。 配制飽和硫酸銨溶液 所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計算： S2S1 V=V0———— 1S2 式中 V,V0—— 分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積 S2,S1—— 分別為所需達到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度 b. 添加固體硫酸銨 適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達到的鹽濃度又很高時。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過 40％。 ? 2）冰箱中（ 4℃ ）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。 Ks代表鹽析效率 ，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度， Ks越大鹽析效果越好。 ?3) pH值： 等電點處最易沉淀。某些對溫度敏感的酶，可在 0℃ ～ 4℃ 下操作 。 ? ?4. 影響有機溶劑沉淀的因素 （ 1）溫度 ： 低溫（ 0℃ ）操作。 2. 沉淀劑： 常用 聚乙二醇 （ Polyethyene glycol，簡寫 PEG ） 多用分子量為 6000～ 20220的 PEG。 ?（五）選擇性變性沉淀法 ? 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。 六、萃?。?extraction）分離 利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。 萃取液 ： 經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與 萃取劑形成的溶液 。 ? 在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑里，達到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)。由于形成的兩相均有很高的含水量（達 70%?90%），故稱 “ 雙水相 ” 系統(tǒng)。 ?3. 應(yīng)用 ? 胞內(nèi)酶的提取和精制 : ? 除去細胞碎片，并使酶得到純化。 臨界點的概念 可用臨界溫度和臨界壓力解釋： ?臨界溫度： 高于此溫度時，無論加壓多大也不能使氣體液化。 ?基本過程： ?1）在 SCF中，溶解度大的物質(zhì)溶于其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)分開。 表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超過臨界膠束濃度。 第二步： 將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相 中，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的反萃取過程。 ?（ 2） 非極性有機溶劑 環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。 ? 4）破壁功能，直接從完整細胞提取酶蛋白。 （一） 擴散膜分離 —— 透析 （ dialysis）