現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究方法學(xué)生-wenkub
2023-01-31 10:33:28 本頁(yè)面
【正文】 BIAcore生物分子相互作用分析（ Biomolecular Interaction Analysis） ? 基于表面等離子體共振（ SPR）來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤生物分子間的相互作用的技術(shù)。它由雙鏈 RNA產(chǎn)生，可以特異性地降解具有相同或者相似序列的 RNA（包括 mRNA）。如果以內(nèi)源的一些參照為標(biāo)準(zhǔn)，還可以用于研究細(xì)胞內(nèi)特定基因的 mRNA的表達(dá)水平?，F(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué) 研究方法 吳 喬 Add：生物館 II 322 Tel： 2187959 基因研究的各種方法 Northern blotting 關(guān)鍵點(diǎn)： DNA探針， 標(biāo)記試劑盒（同位素和 非同位素）；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 優(yōu)點(diǎn)：特異性和敏感性高 缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)繁瑣，同位素 基因水平的檢測(cè) 同位素標(biāo)記細(xì)胞中的受體基因表達(dá)水平 RTPCR ? RTPCR主要由兩大步驟組成，一是反轉(zhuǎn)錄（ RT），二是 PCR。 關(guān)鍵點(diǎn)： mRNA，相關(guān)引物， PCR儀 不足：只能相對(duì)定量，不能 絕對(duì)定量 （ reverse transcriptionpolymerase chain reaction) Realtime PCR ? 實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的基因定量檢測(cè)技術(shù)，它通過(guò) PCR擴(kuò)增中 Tag酶的 5’ － 3’ 的核酸外切酶活性，可以將標(biāo)記在探針上的熒光基團(tuán)一淬滅基團(tuán)分離，使熒光基團(tuán)脫離淬滅基團(tuán)的控制，從而產(chǎn)生熒光發(fā)射。它是一種比反義技術(shù)更為有效的方法，具有更高的特異性。 ? 被廣泛應(yīng)用于各類生物體系的測(cè)定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞。通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA相互作用的信息。 蛋白標(biāo)記和定位 熒光顯微鏡技術(shù) ? 不同熒光素的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍是不同的 ， 所以同一樣品可以同時(shí)用兩種以上的熒光素標(biāo)記 。 ? 優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，可以實(shí)時(shí)跟蹤觀察 光漂白后熒光恢復(fù) (FRAP) ? 光漂白后熒光恢復(fù) : 就是在光漂白后對(duì)樣本確定區(qū)中的熒光恢復(fù)。 光漂白中的熒光損失 (FLIP) ? 光漂白中的熒光損失：是一個(gè)鄰近重復(fù)漂白區(qū)的被定義區(qū)域內(nèi)熒光的減少或消失。 ? 最常用的兩種細(xì)胞融合： NIH3T3, HeLa ? 研究過(guò)程需要用 CHX， 以抑制新的蛋白合成 小鼠成纖維細(xì)胞 :NIH3T3 人宮頸癌細(xì)胞 :HeLa 相差顯微鏡技術(shù) ? 相差顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡最主要的不同點(diǎn)是在物鏡后面安裝一塊“相差板”，偏轉(zhuǎn)的光線分別通過(guò)相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對(duì)樣品不同密度造成的相位差起了放大的作用。 流式細(xì)胞術(shù)定量蛋白表達(dá)量 限制：僅用于膜蛋白含量的檢測(cè)。 ? 它在線粒體上以單體和聚合體兩種不同的物理形式存在。 ? 質(zhì)譜分析 ：通過(guò)酶解產(chǎn)生肽段片段，通過(guò)質(zhì)譜儀分析肽指紋圖譜，從而獲得氨基酸序列，再與網(wǎng)上蛋白庫(kù)匹配，來(lái)確定是已知還是未知蛋白。 核磁共振儀分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 核磁共振圖譜 計(jì)算方程： lg(Fo/F1)=lgKA+nlg[Q]； 其中： Fo， F分別為蛋白質(zhì)與藥物作用前后的熒光強(qiáng)度； [Q]為藥物濃度； KA為結(jié)合常數(shù)。 相互作用分析包括：分子結(jié)合定量分析 , 動(dòng)力學(xué)和親和性分析，結(jié)合能力和協(xié)同性分析（結(jié)合速率 Ka，解離速率Kd，結(jié)合常數(shù) KD） 不用對(duì)樣品作任何標(biāo)記和修飾 圓二色譜分析蛋白構(gòu)象改變 旋光值計(jì)算： 分子對(duì)接模擬預(yù)測(cè)化合物與蛋白結(jié)合的模型 O HH O OOOKd= ?M O HH O OOKd: ND A320nmR adius (cm) Comp o u n d B T R3 A320nmR adius (c m) TR 3 + C o m p o u n d B6. 95 7. 00 7. 05 7. 100. 00. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 7 A320nmR a dius (c m ) Com po un d B G ST G ST+ Com po un d B A280nmR a dius (c m ) Co m po un d B TR3 TR3 + Com po un d B分析超離方法檢測(cè)化合物與蛋白的相互作用 原子力顯微鏡 (AFM) ? 優(yōu)點(diǎn)： 1)原子力顯微鏡作為掃描探針顯微鏡的一種 ， 可觀察生物形態(tài)結(jié)構(gòu) 。 透射電子顯微 鏡 TEM優(yōu)點(diǎn)： 1，極高的分辨率和放大倍數(shù) 。 2，對(duì)單個(gè)原子顯微觀察不理想 。蛋白質(zhì)的功能與其空間定位有著密切的相關(guān)，且 通過(guò)在不同亞細(xì)胞環(huán)境里的轉(zhuǎn)位而發(fā)揮作用。 蛋白降解的系統(tǒng) 溶酶體蛋白溶解系統(tǒng) 非溶酶體蛋白溶解系統(tǒng) 泛素 — 蛋白酶系統(tǒng) 鈣依賴性的 蛋白溶解系統(tǒng) 泛素、 26s蛋白酶體、 酶系統(tǒng) (E E E E4 、 泛素 C— 末端水解酶 ) 普遍存在于原核生物和真核生物細(xì)胞中，是真核細(xì)胞內(nèi)最重要的非溶酶體性的蛋白溶解系統(tǒng) 主要功能是降解機(jī)體正常情況下特 別是應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的異常細(xì)胞漿 內(nèi)短壽命蛋白質(zhì)，包括一些重要的 調(diào)節(jié)蛋白如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào) 節(jié)因子和信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子等。 泛素的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括了 5個(gè) β折疊， 35個(gè) α螺旋及 7個(gè)反螺旋，其外觀是一個(gè)緊密壓縮的球狀蛋白質(zhì)，從球體的表面伸出 4個(gè) C末端殘基，作為泛素化蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn) . 泛素肽鏈中約 70%由氫鍵組成，決定了它的熱穩(wěn)定特性及耐受寬范圍的pH值。 ? 泛素 蛋白連接酶 (UbiquitinProtin Ligases, E3)：一類大分子蛋白質(zhì) ， 結(jié)構(gòu)復(fù)雜 ， 主要作用是特異識(shí)別靶蛋白 ， 并將其傳遞給蛋白酶體降解 。 α亞基主要用于底物識(shí)別， β亞基主要參與底物降解。 SUMO家族成員都有獨(dú)特的 N端氨基酸序列和碳端外延序列。 形成異肽鍵所需的甘氨酸殘基在泛素和 SUMO1中是保守的 。有的 SUMO底物蛋白需要 E3聯(lián)接酶來(lái)促進(jìn)它們的 SUMO化 ,有的不需要 E3。 IκB經(jīng)腫瘤壞死因子 TNF的刺激 ， 在 S32和 S36發(fā)生磷酸化 ， 進(jìn)而被泛素化 。 轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化、去磷酸化可能影響： 1）轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)或相反。
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