現(xiàn)代細胞生物學研究方法學生-wenkub
2023-01-31 10:33:28 本頁面
【正文】 BIAcore生物分子相互作用分析（ Biomolecular Interaction Analysis） ? 基于表面等離子體共振（ SPR）來實時跟蹤生物分子間的相互作用的技術。它由雙鏈 RNA產生，可以特異性地降解具有相同或者相似序列的 RNA（包括 mRNA）。如果以內源的一些參照為標準，還可以用于研究細胞內特定基因的 mRNA的表達水平?，F(xiàn)代細胞分子生物學 研究方法 吳 喬 Add：生物館 II 322 Tel： 2187959 基因研究的各種方法 Northern blotting 關鍵點： DNA探針， 標記試劑盒（同位素和 非同位素）；設內標； 優(yōu)點：特異性和敏感性高 缺點：實驗繁瑣，同位素 基因水平的檢測 同位素標記細胞中的受體基因表達水平 RTPCR ? RTPCR主要由兩大步驟組成，一是反轉錄（ RT），二是 PCR。 關鍵點： mRNA，相關引物， PCR儀 不足：只能相對定量，不能 絕對定量 （ reverse transcriptionpolymerase chain reaction) Realtime PCR ? 實時定量 PCR技術是近年來發(fā)展起來的一種新的基因定量檢測技術，它通過 PCR擴增中 Tag酶的 5’ － 3’ 的核酸外切酶活性，可以將標記在探針上的熒光基團一淬滅基團分離，使熒光基團脫離淬滅基團的控制，從而產生熒光發(fā)射。它是一種比反義技術更為有效的方法，具有更高的特異性。 ? 被廣泛應用于各類生物體系的測定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細胞。通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與 DNA相互作用的信息。 蛋白標記和定位 熒光顯微鏡技術 ? 不同熒光素的激發(fā)光波長范圍是不同的 ， 所以同一樣品可以同時用兩種以上的熒光素標記 。 ? 優(yōu)點：分辨率高，可以實時跟蹤觀察 光漂白后熒光恢復 (FRAP) ? 光漂白后熒光恢復 : 就是在光漂白后對樣本確定區(qū)中的熒光恢復。 光漂白中的熒光損失 (FLIP) ? 光漂白中的熒光損失：是一個鄰近重復漂白區(qū)的被定義區(qū)域內熒光的減少或消失。 ? 最常用的兩種細胞融合： NIH3T3, HeLa ? 研究過程需要用 CHX， 以抑制新的蛋白合成 小鼠成纖維細胞 :NIH3T3 人宮頸癌細胞 :HeLa 相差顯微鏡技術 ? 相差顯微鏡和普通光學顯微鏡最主要的不同點是在物鏡后面安裝一塊“相差板”，偏轉的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對樣品不同密度造成的相位差起了放大的作用。 流式細胞術定量蛋白表達量 限制：僅用于膜蛋白含量的檢測。 ? 它在線粒體上以單體和聚合體兩種不同的物理形式存在。 ? 質譜分析 ：通過酶解產生肽段片段，通過質譜儀分析肽指紋圖譜，從而獲得氨基酸序列，再與網上蛋白庫匹配，來確定是已知還是未知蛋白。 核磁共振儀分析蛋白質的二級結構 核磁共振圖譜 計算方程： lg(Fo/F1)=lgKA+nlg[Q]； 其中： Fo， F分別為蛋白質與藥物作用前后的熒光強度； [Q]為藥物濃度； KA為結合常數(shù)。 相互作用分析包括：分子結合定量分析 , 動力學和親和性分析，結合能力和協(xié)同性分析（結合速率 Ka，解離速率Kd，結合常數(shù) KD） 不用對樣品作任何標記和修飾 圓二色譜分析蛋白構象改變 旋光值計算： 分子對接模擬預測化合物與蛋白結合的模型 O HH O OOOKd= ?M O HH O OOKd: ND A320nmR adius (cm) Comp o u n d B T R3 A320nmR adius (c m) TR 3 + C o m p o u n d B6. 95 7. 00 7. 05 7. 100. 00. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 7 A320nmR a dius (c m ) Com po un d B G ST G ST+ Com po un d B A280nmR a dius (c m ) Co m po un d B TR3 TR3 + Com po un d B分析超離方法檢測化合物與蛋白的相互作用 原子力顯微鏡 (AFM) ? 優(yōu)點： 1)原子力顯微鏡作為掃描探針顯微鏡的一種 ， 可觀察生物形態(tài)結構 。 透射電子顯微 鏡 TEM優(yōu)點： 1，極高的分辨率和放大倍數(shù) 。 2，對單個原子顯微觀察不理想 。蛋白質的功能與其空間定位有著密切的相關，且 通過在不同亞細胞環(huán)境里的轉位而發(fā)揮作用。 蛋白降解的系統(tǒng) 溶酶體蛋白溶解系統(tǒng) 非溶酶體蛋白溶解系統(tǒng) 泛素 — 蛋白酶系統(tǒng) 鈣依賴性的 蛋白溶解系統(tǒng) 泛素、 26s蛋白酶體、 酶系統(tǒng) (E E E E4 、 泛素 C— 末端水解酶 ) 普遍存在于原核生物和真核生物細胞中，是真核細胞內最重要的非溶酶體性的蛋白溶解系統(tǒng) 主要功能是降解機體正常情況下特 別是應激狀態(tài)下產生的異常細胞漿 內短壽命蛋白質，包括一些重要的 調節(jié)蛋白如轉錄因子、細胞周期調 節(jié)因子和信號轉錄因子等。 泛素的二級結構包括了 5個 β折疊， 35個 α螺旋及 7個反螺旋，其外觀是一個緊密壓縮的球狀蛋白質，從球體的表面伸出 4個 C末端殘基，作為泛素化蛋白質的結合位點 . 泛素肽鏈中約 70%由氫鍵組成，決定了它的熱穩(wěn)定特性及耐受寬范圍的pH值。 ? 泛素 蛋白連接酶 (UbiquitinProtin Ligases, E3)：一類大分子蛋白質 ， 結構復雜 ， 主要作用是特異識別靶蛋白 ， 并將其傳遞給蛋白酶體降解 。 α亞基主要用于底物識別， β亞基主要參與底物降解。 SUMO家族成員都有獨特的 N端氨基酸序列和碳端外延序列。 形成異肽鍵所需的甘氨酸殘基在泛素和 SUMO1中是保守的 。有的 SUMO底物蛋白需要 E3聯(lián)接酶來促進它們的 SUMO化 ,有的不需要 E3。 IκB經腫瘤壞死因子 TNF的刺激 ， 在 S32和 S36發(fā)生磷酸化 ， 進而被泛素化 。 轉錄因子的磷酸化、去磷酸化可能影響： 1）轉錄因子從細胞質向細胞核轉運或相反。
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