【正文】 白 ， 并將其傳遞給蛋白酶體降解 。 2，對(duì)單個(gè)原子顯微觀察不理想 。 ? 質(zhì)譜分析 ：通過(guò)酶解產(chǎn)生肽段片段，通過(guò)質(zhì)譜儀分析肽指紋圖譜，從而獲得氨基酸序列，再與網(wǎng)上蛋白庫(kù)匹配，來(lái)確定是已知還是未知蛋白。 光漂白中的熒光損失 (FLIP) ? 光漂白中的熒光損失：是一個(gè)鄰近重復(fù)漂白區(qū)的被定義區(qū)域內(nèi)熒光的減少或消失。 ? 被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)生物體系的測(cè)定，從各類(lèi)小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類(lèi)脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞。如果以?xún)?nèi)源的一些參照為標(biāo)準(zhǔn)，還可以用于研究細(xì)胞內(nèi)特定基因的 mRNA的表達(dá)水平。 DNA affinity purification assay （ DAPA） ? 合成擬分析的 DNA片段，在 DNA片段的末端接上biotin作為探針與核蛋白孵育，再與能耦合生物素的瓊脂糖珠子免疫沉淀，最后利用 western blot的方式分析，從而獲得與 DNA探針相互作用的蛋白質(zhì)信息。所以細(xì)胞表現(xiàn)出不同的熒光值。 antibodyantigen, receptorligand, DNADNA, DNAprotein, proteinsmall molecular etc. 全自動(dòng)，高通量，實(shí)時(shí)檢測(cè)，快速分析生物分子之間的相互作用 。因此， 只有系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的定位、翻譯后修飾及 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)相互作用的規(guī)律，才能從真正意義上闡明一個(gè)蛋白質(zhì)的 功能，才有可能研究細(xì)胞中某一生理活動(dòng)中相關(guān)功能蛋白質(zhì)的作用及機(jī)制 。它們廣泛存在于原生動(dòng)物、后生動(dòng)物、植物和真菌中，顯示了 SUMO在進(jìn)化上的保守性。 IκB NFκB SUMO Ubiquitination TNF NFκB IκB Three 在許多蛋白特別是轉(zhuǎn)錄因子中都存在磷酸化和去磷酸化作用。 ? CBP/p300可抑制腫瘤的形成，在小鼠瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) CBP突變，在結(jié)腸和乳房瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn) p300突變。在細(xì)胞核中， RanGTP 和 importin?相互作用，使輸入蛋白解體。 ◆ 核孔復(fù)合體裝臵 ：生長(zhǎng)抑制期的細(xì)胞核孔通道有效直徑明顯低于細(xì)胞增殖期的有效直徑；在增殖細(xì)胞核中 ， 核孔通透性或核孔數(shù)目也不同于生長(zhǎng)抑制期的細(xì)胞 。 為蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量 Ran GTP Ran是一種核蛋白 ， 分子量為 25KD， 通過(guò)與不同的效應(yīng)蛋白共同作用而相互調(diào)控 。 5，蛋白因子上被修飾的氨基酸殘基不同，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子功能的影響也不同。 IκB是 NFκB的抑制因子 ， NFκB在胞漿中由于和 IκB結(jié)合呈現(xiàn)無(wú)活性的狀態(tài) 。 蛋白酶體（ 26s）包括一個(gè) 20s的中心顆粒和一個(gè) 19s的調(diào)節(jié)顆粒，在20s顆粒中心由七個(gè)亞基的四個(gè)環(huán)組成一個(gè)中空室。 不足： 1，分辨率較低（ 30－ 60埃） 2，觀察 “ 死 ” 樣品 3，觀察樣品表面 蛋白修飾 ? 泛素化 (ubiquitination) ? 類(lèi)泛素化 (sumoylation) ? 甲基化 (methylation) ? 乙?；? (acetylation) ? 磷酸化 (phosphorylation) …………… 國(guó)家自然科學(xué)基金 國(guó)家“ 973” 重大研究計(jì)劃 研究的必要性和重要性 蛋白質(zhì)是基因功能的實(shí)施者，蛋白質(zhì)的定位、翻譯后修飾及蛋白質(zhì) 蛋白 質(zhì)相互作用決定了蛋白質(zhì)的功能，也為研究細(xì)胞生長(zhǎng)，分化和凋亡及重大疾 病發(fā)生和發(fā)展提供了基礎(chǔ)。 ? 用于測(cè)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu) 相對(duì) 變化和變化速度的方法有： 熒光滴定技術(shù) ，紫外差吸收， 園二色光譜 ，紅外光譜 ， Raman光譜 ，脲梯度電泳，各種反應(yīng)基團(tuán)的暴露。 目前比較有效的融合劑是高 pH，高 Ca， 和聚乙二醇 PEG。 ? ?實(shí)驗(yàn)過(guò)程： DNA片段 (probe)進(jìn)行末端標(biāo)記（同位素、生物素或熒光） ?probe與核蛋白孵育 電泳 干膠 曝光 染色質(zhì)免疫共沉淀 （ ChIP） ? 利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的 DNA片段沉淀下來(lái)?，F(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué) 研究方法 吳 喬 Add：生物館 II 322 Tel： 2187959 基因研究的各種方法 Northern blotting 關(guān)鍵點(diǎn)： DNA探針， 標(biāo)記試劑盒（同位素和 非同位素）；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 優(yōu)點(diǎn)：特異性和敏感性高 缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)繁瑣，同位素 基因水平的檢測(cè) 同位素標(biāo)記細(xì)胞中的受體基因表達(dá)水平 RTPCR ? RTPCR主要由兩大步驟組成，一是反轉(zhuǎn)錄（ RT），二是 PCR。通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA相互作用的信息。 ? 最常用的兩種細(xì)胞融合： NIH3T3, HeLa ? 研究過(guò)程需要用 CHX， 以抑制新的蛋白合成 小鼠成纖維細(xì)胞 :NIH3T3 人宮頸癌細(xì)胞 :HeLa 相差顯微鏡技術(shù) ? 相差顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡最主要的不同點(diǎn)是在物鏡后面安裝一塊“相差板”，偏轉(zhuǎn)的光線分別通過(guò)相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對(duì)樣品不同密度造成的相位差起了放大的作用。 核磁共振儀分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 核磁共振圖譜 計(jì)算方程： lg(Fo/F1)=lgKA+nlg[Q]； 其中： Fo， F分別為蛋白質(zhì)與藥物作用前后的熒光強(qiáng)度； [Q]為藥物濃度； KA為結(jié)合常數(shù)。蛋白質(zhì)的功能與其空間定位有著密切的相關(guān)，且 通過(guò)在不同亞細(xì)胞環(huán)境里的轉(zhuǎn)位而發(fā)揮作用。 α亞基主要用于底物識(shí)別， β亞基主要參與底物降解。 IκB經(jīng)腫瘤壞死因子 TNF的刺激 ， 在 S32和 S36發(fā)生磷酸化 ， 進(jìn)而被泛素化 。 磷酸化研究方法 ? 特異性磷酸化抗體直接證明 ? CIAP或 OA間接證明 ? 片段缺失突變和點(diǎn)突變直接證明 ? 同位素標(biāo)記 ? 質(zhì)譜分析 CIAP或 OA處理細(xì)胞證明蛋白磷酸化 CIAP：牛小腸堿性磷酸酶，能夠?qū)?DNA以及蛋白上的磷酸根基團(tuán)去除（孵育蛋白）； OA：岡田酸，磷酸酶抑制劑（細(xì)胞處理） 片段缺失突變確定磷酸化的初步位點(diǎn) 點(diǎn)突變確定磷酸化的精確位點(diǎn) (For Erk/MAPK) AKT: RXRXXS TR3: RDHLAS Motif 原理：將未被磷酸化的蛋白與被磷酸化后的蛋白用蛋白酶水解后，進(jìn)行 MS/MS分析，到數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。 效應(yīng)蛋白： Ran GTPase激活蛋白： RanGAP (細(xì)胞質(zhì) ) RanGAP結(jié)合蛋白： RanBP1 和 RanBP2 (細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞核 ) 鳥(niǎo)嘌呤核苷交換因子： RanGEF（ 也稱(chēng) RCC1） 細(xì)胞核中 RanGTP再生 核轉(zhuǎn)運(yùn)因子 2(NTF2