【正文】 白 ， 并將其傳遞給蛋白酶體降解 。 2，對單個原子顯微觀察不理想 。 ? 質(zhì)譜分析 ：通過酶解產(chǎn)生肽段片段，通過質(zhì)譜儀分析肽指紋圖譜，從而獲得氨基酸序列，再與網(wǎng)上蛋白庫匹配，來確定是已知還是未知蛋白。 光漂白中的熒光損失 (FLIP) ? 光漂白中的熒光損失：是一個鄰近重復(fù)漂白區(qū)的被定義區(qū)域內(nèi)熒光的減少或消失。 ? 被廣泛應(yīng)用于各類生物體系的測定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細胞。如果以內(nèi)源的一些參照為標(biāo)準(zhǔn)，還可以用于研究細胞內(nèi)特定基因的 mRNA的表達水平。 DNA affinity purification assay （ DAPA） ? 合成擬分析的 DNA片段，在 DNA片段的末端接上biotin作為探針與核蛋白孵育，再與能耦合生物素的瓊脂糖珠子免疫沉淀，最后利用 western blot的方式分析，從而獲得與 DNA探針相互作用的蛋白質(zhì)信息。所以細胞表現(xiàn)出不同的熒光值。 antibodyantigen, receptorligand, DNADNA, DNAprotein, proteinsmall molecular etc. 全自動，高通量，實時檢測，快速分析生物分子之間的相互作用 。因此， 只有系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的定位、翻譯后修飾及 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用的規(guī)律，才能從真正意義上闡明一個蛋白質(zhì)的 功能，才有可能研究細胞中某一生理活動中相關(guān)功能蛋白質(zhì)的作用及機制 。它們廣泛存在于原生動物、后生動物、植物和真菌中，顯示了 SUMO在進化上的保守性。 IκB NFκB SUMO Ubiquitination TNF NFκB IκB Three 在許多蛋白特別是轉(zhuǎn)錄因子中都存在磷酸化和去磷酸化作用。 ? CBP/p300可抑制腫瘤的形成，在小鼠瘤細胞中發(fā)現(xiàn) CBP突變，在結(jié)腸和乳房瘤細胞系中發(fā)現(xiàn) p300突變。在細胞核中， RanGTP 和 importin?相互作用，使輸入蛋白解體。 ◆ 核孔復(fù)合體裝臵 ：生長抑制期的細胞核孔通道有效直徑明顯低于細胞增殖期的有效直徑；在增殖細胞核中 ， 核孔通透性或核孔數(shù)目也不同于生長抑制期的細胞 。 為蛋白轉(zhuǎn)運提供能量 Ran GTP Ran是一種核蛋白 ， 分子量為 25KD， 通過與不同的效應(yīng)蛋白共同作用而相互調(diào)控 。 5，蛋白因子上被修飾的氨基酸殘基不同，對轉(zhuǎn)錄因子功能的影響也不同。 IκB是 NFκB的抑制因子 ， NFκB在胞漿中由于和 IκB結(jié)合呈現(xiàn)無活性的狀態(tài) 。 蛋白酶體（ 26s）包括一個 20s的中心顆粒和一個 19s的調(diào)節(jié)顆粒，在20s顆粒中心由七個亞基的四個環(huán)組成一個中空室。 不足： 1，分辨率較低（ 30－ 60埃） 2，觀察 “ 死 ” 樣品 3，觀察樣品表面 蛋白修飾 ? 泛素化 (ubiquitination) ? 類泛素化 (sumoylation) ? 甲基化 (methylation) ? 乙酰化 (acetylation) ? 磷酸化 (phosphorylation) …………… 國家自然科學(xué)基金 國家“ 973” 重大研究計劃 研究的必要性和重要性 蛋白質(zhì)是基因功能的實施者，蛋白質(zhì)的定位、翻譯后修飾及蛋白質(zhì) 蛋白 質(zhì)相互作用決定了蛋白質(zhì)的功能，也為研究細胞生長，分化和凋亡及重大疾 病發(fā)生和發(fā)展提供了基礎(chǔ)。 ? 用于測定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu) 相對 變化和變化速度的方法有： 熒光滴定技術(shù) ，紫外差吸收， 園二色光譜 ，紅外光譜 ， Raman光譜 ，脲梯度電泳，各種反應(yīng)基團的暴露。 目前比較有效的融合劑是高 pH，高 Ca， 和聚乙二醇 PEG。 ? ?實驗過程： DNA片段 (probe)進行末端標(biāo)記（同位素、生物素或熒光） ?probe與核蛋白孵育 電泳 干膠 曝光 染色質(zhì)免疫共沉淀 （ ChIP） ? 利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的 DNA片段沉淀下來?，F(xiàn)代細胞分子生物學(xué) 研究方法 吳 喬 Add：生物館 II 322 Tel： 2187959 基因研究的各種方法 Northern blotting 關(guān)鍵點： DNA探針， 標(biāo)記試劑盒（同位素和 非同位素）；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 優(yōu)點：特異性和敏感性高 缺點：實驗繁瑣，同位素 基因水平的檢測 同位素標(biāo)記細胞中的受體基因表達水平 RTPCR ? RTPCR主要由兩大步驟組成，一是反轉(zhuǎn)錄（ RT），二是 PCR。通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA相互作用的信息。 ? 最常用的兩種細胞融合： NIH3T3, HeLa ? 研究過程需要用 CHX， 以抑制新的蛋白合成 小鼠成纖維細胞 :NIH3T3 人宮頸癌細胞 :HeLa 相差顯微鏡技術(shù) ? 相差顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡最主要的不同點是在物鏡后面安裝一塊“相差板”，偏轉(zhuǎn)的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對樣品不同密度造成的相位差起了放大的作用。 核磁共振儀分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 核磁共振圖譜 計算方程： lg(Fo/F1)=lgKA+nlg[Q]； 其中： Fo， F分別為蛋白質(zhì)與藥物作用前后的熒光強度； [Q]為藥物濃度； KA為結(jié)合常數(shù)。蛋白質(zhì)的功能與其空間定位有著密切的相關(guān)，且 通過在不同亞細胞環(huán)境里的轉(zhuǎn)位而發(fā)揮作用。 α亞基主要用于底物識別， β亞基主要參與底物降解。 IκB經(jīng)腫瘤壞死因子 TNF的刺激 ， 在 S32和 S36發(fā)生磷酸化 ， 進而被泛素化 。 磷酸化研究方法 ? 特異性磷酸化抗體直接證明 ? CIAP或 OA間接證明 ? 片段缺失突變和點突變直接證明 ? 同位素標(biāo)記 ? 質(zhì)譜分析 CIAP或 OA處理細胞證明蛋白磷酸化 CIAP：牛小腸堿性磷酸酶，能夠?qū)?DNA以及蛋白上的磷酸根基團去除（孵育蛋白）； OA：岡田酸，磷酸酶抑制劑（細胞處理） 片段缺失突變確定磷酸化的初步位點 點突變確定磷酸化的精確位點 (For Erk/MAPK) AKT: RXRXXS TR3: RDHLAS Motif 原理：將未被磷酸化的蛋白與被磷酸化后的蛋白用蛋白酶水解后，進行 MS/MS分析，到數(shù)據(jù)庫進行比對。 效應(yīng)蛋白： Ran GTPase激活蛋白： RanGAP (細胞質(zhì) ) RanGAP結(jié)合蛋白： RanBP1 和 RanBP2 (細胞質(zhì) 細胞核 ) 鳥嘌呤核苷交換因子： RanGEF（ 也稱 RCC1） 細胞核中 RanGTP再生 核轉(zhuǎn)運因子 2(NTF2