【正文】 塊“相差板”，偏轉(zhuǎn)的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對(duì)樣品不同密度造成的相位差起了放大的作用。 細(xì)胞異體融合 ? 通過誘導(dǎo)融合劑可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合 。 光漂白中的熒光損失 (FLIP) ? 光漂白中的熒光損失：是一個(gè)鄰近重復(fù)漂白區(qū)的被定義區(qū)域內(nèi)熒光的減少或消失。 ? FRAP用于測(cè)量 2維或 3維分子運(yùn)動(dòng)的力度。 ? 優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，可以實(shí)時(shí)跟蹤觀察 光漂白后熒光恢復(fù) (FRAP) ? 光漂白后熒光恢復(fù) : 就是在光漂白后對(duì)樣本確定區(qū)中的熒光恢復(fù)。 熒光顯微鏡中只有激發(fā)熒光可以成象 ， 因?yàn)楫a(chǎn)生激發(fā)光的光全被樣品與照相機(jī)之間的濾光片吸收 。 蛋白標(biāo)記和定位 熒光顯微鏡技術(shù) ? 不同熒光素的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍是不同的 ， 所以同一樣品可以同時(shí)用兩種以上的熒光素標(biāo)記 。 ? ChIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍： CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的 ChIPonchip 方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量 篩選； ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找 反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)； RNAChIP用于研 究 RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA相互作用的信息。 凝膠阻抑實(shí)驗(yàn) （ Gel retardation assay） ? 當(dāng) DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)的 DNA片段或寡核苷酸結(jié)合而形成 DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物后，使 DNA片段的分子量及電荷發(fā)生改變，因而在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中其電泳遷移率發(fā)生改變，通常較游離的DNA片段的泳動(dòng)速率慢得多，在X光膠片上形成一較游離 DNA片段滯后的帶型。 ? 被廣泛應(yīng)用于各類生物體系的測(cè)定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞。 這種方法可以分析溶液中 、 細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白 ， 但只能是定性或半定量的實(shí)驗(yàn) 。它是一種比反義技術(shù)更為有效的方法，具有更高的特異性。 ? 關(guān)鍵點(diǎn)：引物設(shè)計(jì)， realtime PCR儀 倍數(shù)差 原位雜交定位基因的表達(dá) 1， 組織 /細(xì)胞固定 脫水 石蠟包埋 切片 2， DNA 探針的制備（地高辛或同位素標(biāo)記） 3，探針標(biāo)記 mRNA顯示 mRNA 4，顯微鏡觀察 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的 DNA 探針；地高辛試劑盒或同位素，切片機(jī)；對(duì)照組的設(shè)臵 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 KAI1 RNA干擾技術(shù) ? 發(fā)現(xiàn)者獲得諾貝爾獎(jiǎng)； ? RNA干擾 (RNA interference， RNAi)是一種可以在細(xì)胞內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象。 關(guān)鍵點(diǎn)： mRNA，相關(guān)引物， PCR儀 不足：只能相對(duì)定量，不能 絕對(duì)定量 （ reverse transcriptionpolymerase chain reaction) Realtime PCR ? 實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的基因定量檢測(cè)技術(shù)，它通過 PCR擴(kuò)增中 Tag酶的 5’ － 3’ 的核酸外切酶活性，可以將標(biāo)記在探針上的熒光基團(tuán)一淬滅基團(tuán)分離，使熒光基團(tuán)脫離淬滅基團(tuán)的控制，從而產(chǎn)生熒光發(fā)射。 ? RTPCR的用途很廣泛，既可以用來構(gòu)建 cDNA文庫(kù)，也可以獲得感興趣的基因的 cDNA序列?，F(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué) 研究方法 吳 喬 Add：生物館 II 322 Tel： 2187959 基因研究的各種方法 Northern blotting 關(guān)鍵點(diǎn)： DNA探針， 標(biāo)記試劑盒（同位素和 非同位素）；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 優(yōu)點(diǎn)：特異性和敏感性高 缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)繁瑣，同位素 基因水平的檢測(cè) 同位素標(biāo)記細(xì)胞中的受體基因表達(dá)水平 RTPCR ? RTPCR主要由兩大步驟組成，一是反轉(zhuǎn)錄（ RT），二是 PCR。它與普通 PCR的區(qū)別就在于它是以 mRNA為最初始的模板。如果以內(nèi)源的一些參照為標(biāo)準(zhǔn)，還可以用于研究細(xì)胞內(nèi)特定基因的 mRNA的表達(dá)水平。通過熒光吸收裝臵檢測(cè)發(fā)出熒光的多少來反映模板量的高低，從而達(dá)到實(shí)時(shí)定量的目的。它由雙鏈 RNA產(chǎn)生，可以特異性地降解具有相同或者相似序列的 RNA（包括 mRNA）。 關(guān)鍵點(diǎn)：確定 19－ 21寡核苷酸（一條基因上有許多條候選 寡核苷酸） ，cDNA轉(zhuǎn)錄成 mRNA的試劑盒（效果好但價(jià)格貴），或表達(dá)載體 pSuper, 轉(zhuǎn)染試劑盒；要設(shè)臵好對(duì)照（不相關(guān)的序列） 不足：干擾不夠穩(wěn)定、不完全，不能長(zhǎng)時(shí)間作用 ? 熒光酶基因（ Luc）是從螢火蟲 cDNA文庫(kù)中克隆的 ? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織沒有任何內(nèi)源性熒光素酶活力，所以 Luc可作為非常靈敏的遺傳報(bào)告基因 ? 熒光酶報(bào)告基因具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、費(fèi)用低、用途廣、可定量等優(yōu)點(diǎn) 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) （熒光素酶檢測(cè)方法） 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) （熒光素酶檢測(cè)方法） 關(guān)鍵點(diǎn)： Luciferase報(bào)告基因，表達(dá)載體， ?gal, 轉(zhuǎn)染效率，熒光檢測(cè)儀 基因芯片分析 ? 設(shè)臵好對(duì)照組，取樣（ mRNA） ? 由公司測(cè)定，提供基因檢測(cè)結(jié)果（根據(jù)細(xì)胞功能分類） ? 排除變化相同的基因 ? 確定變化差異的基因 ? 選擇感興趣的基因進(jìn)一步證實(shí)它們的變化 ? 該方法特別適合用于信號(hào)通路中新的下游靶基因的發(fā)現(xiàn) 蛋白研究的各種方法 Western blotting 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的抗體； ECL顯示試劑；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 不同抗體差別很大：用量、效果、特異性 使用的電泳膠的濃度與蛋白的分子量密切相關(guān) （反比關(guān)系） 優(yōu)點(diǎn)：可用于定量分析 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 蛋白半衰期 CHX(cycloheximide) 放線菌酮 有的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的半衰期很短 CHX的作用是抑制新蛋白的合成 免疫組織化學(xué)方法顯示蛋白 1， 組織 /細(xì)胞固定 脫水 石蠟包埋 切片 2，免疫組化染色 3，顯微鏡觀察 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的抗體；切片機(jī)； 對(duì)照組的設(shè)臵 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 蛋白的相互作用和 蛋白與 DNA的結(jié)合分析 免疫沉淀 /免疫印跡 (CoIP) Immunoprecipitation/Western blot ? 用特異性抗體結(jié)合細(xì)胞裂解液中的某個(gè)目的蛋白質(zhì) （ 即免疫沉淀 ） ， 洗滌后解離特異性抗體和目的蛋白質(zhì) ， 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） ， 最后用 Western blot 分析顯示另一個(gè)目的蛋白質(zhì) 。 BIAcore生物分子相互作用分析（ Biomolecular Interaction Analysis） ? 基于表面等離子體共振（ SPR）來實(shí)時(shí)跟蹤生物分子間的相互作用的技術(shù)。 ? 具有高天然性