【正文】 觀察樣品表現(xiàn)形貌獲得 多方面資料 6，可進(jìn)行微區(qū)成分分析。 ? AFM對(duì)于生物系統(tǒng)的成像分析比光學(xué)顯微鏡具有更高的分辨率 （ 大約可以到 1nm） ， 比電鏡觀察所需要的樣品處理更接近于生理?xiàng)l件 ， 并且比光譜學(xué)技術(shù) （ 通常需要從大量光譜信號(hào)中間接推導(dǎo)出結(jié)構(gòu)信息 ） 更直觀 。 ? 二維 核磁共振 技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)分子在溶液中的結(jié)構(gòu)。 蛋白表達(dá)量以面積表示。 細(xì)胞異體融合 ? 通過誘導(dǎo)融合劑可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合 。 熒光顯微鏡中只有激發(fā)熒光可以成象 ， 因?yàn)楫a(chǎn)生激發(fā)光的光全被樣品與照相機(jī)之間的濾光片吸收 。 凝膠阻抑實(shí)驗(yàn) （ Gel retardation assay） ? 當(dāng) DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)的 DNA片段或寡核苷酸結(jié)合而形成 DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物后，使 DNA片段的分子量及電荷發(fā)生改變，因而在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中其電泳遷移率發(fā)生改變，通常較游離的DNA片段的泳動(dòng)速率慢得多，在X光膠片上形成一較游離 DNA片段滯后的帶型。 ? 關(guān)鍵點(diǎn)：引物設(shè)計(jì)， realtime PCR儀 倍數(shù)差 原位雜交定位基因的表達(dá) 1， 組織 /細(xì)胞固定 脫水 石蠟包埋 切片 2， DNA 探針的制備（地高辛或同位素標(biāo)記） 3，探針標(biāo)記 mRNA顯示 mRNA 4，顯微鏡觀察 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的 DNA 探針；地高辛試劑盒或同位素，切片機(jī)；對(duì)照組的設(shè)臵 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 KAI1 RNA干擾技術(shù) ? 發(fā)現(xiàn)者獲得諾貝爾獎(jiǎng)； ? RNA干擾 (RNA interference， RNAi)是一種可以在細(xì)胞內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象。它與普通 PCR的區(qū)別就在于它是以 mRNA為最初始的模板。 關(guān)鍵點(diǎn)：確定 19－ 21寡核苷酸（一條基因上有許多條候選 寡核苷酸） ，cDNA轉(zhuǎn)錄成 mRNA的試劑盒（效果好但價(jià)格貴），或表達(dá)載體 pSuper, 轉(zhuǎn)染試劑盒；要設(shè)臵好對(duì)照（不相關(guān)的序列） 不足：干擾不夠穩(wěn)定、不完全，不能長(zhǎng)時(shí)間作用 ? 熒光酶基因（ Luc）是從螢火蟲 cDNA文庫(kù)中克隆的 ? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織沒有任何內(nèi)源性熒光素酶活力，所以 Luc可作為非常靈敏的遺傳報(bào)告基因 ? 熒光酶報(bào)告基因具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、費(fèi)用低、用途廣、可定量等優(yōu)點(diǎn) 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) （熒光素酶檢測(cè)方法） 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) （熒光素酶檢測(cè)方法） 關(guān)鍵點(diǎn)： Luciferase報(bào)告基因，表達(dá)載體， ?gal, 轉(zhuǎn)染效率，熒光檢測(cè)儀 基因芯片分析 ? 設(shè)臵好對(duì)照組，取樣（ mRNA） ? 由公司測(cè)定，提供基因檢測(cè)結(jié)果（根據(jù)細(xì)胞功能分類） ? 排除變化相同的基因 ? 確定變化差異的基因 ? 選擇感興趣的基因進(jìn)一步證實(shí)它們的變化 ? 該方法特別適合用于信號(hào)通路中新的下游靶基因的發(fā)現(xiàn) 蛋白研究的各種方法 Western blotting 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的抗體； ECL顯示試劑；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 不同抗體差別很大：用量、效果、特異性 使用的電泳膠的濃度與蛋白的分子量密切相關(guān) （反比關(guān)系） 優(yōu)點(diǎn)：可用于定量分析 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 蛋白半衰期 CHX(cycloheximide) 放線菌酮 有的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的半衰期很短 CHX的作用是抑制新蛋白的合成 免疫組織化學(xué)方法顯示蛋白 1， 組織 /細(xì)胞固定 脫水 石蠟包埋 切片 2，免疫組化染色 3，顯微鏡觀察 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的抗體；切片機(jī)； 對(duì)照組的設(shè)臵 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 蛋白的相互作用和 蛋白與 DNA的結(jié)合分析 免疫沉淀 /免疫印跡 (CoIP) Immunoprecipitation/Western blot ? 用特異性抗體結(jié)合細(xì)胞裂解液中的某個(gè)目的蛋白質(zhì) （ 即免疫沉淀 ） ， 洗滌后解離特異性抗體和目的蛋白質(zhì) ， 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） ， 最后用 Western blot 分析顯示另一個(gè)目的蛋白質(zhì) 。 ? ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)蛋白與 DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。 ? FRAP是由沒有漂白的熒光團(tuán)從周圍進(jìn)入漂白區(qū)的運(yùn)動(dòng)引起的。 最后，這兩組光線經(jīng)過透鏡又會(huì)聚 成一束，發(fā)生互相疊加或抵消的干 涉現(xiàn)象，從而表現(xiàn)出肉眼明顯可見 的明暗區(qū)別。 ? JC－ 1特異地與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，只在線粒體膜電位崩解的時(shí)候才釋放出來，因此，檢驗(yàn)結(jié)果可靠，敏感性高。 以 lg(Fo/F1)對(duì) lg[Q]作圖，可求得藥物與蛋白分子的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。 2，樣品室往多功能發(fā)展 。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾對(duì)蛋白質(zhì) 發(fā)揮正常功能具有重要作用，經(jīng)過特殊修飾的蛋白質(zhì)通?？啥ㄎ辉谔囟ǖ奈? 臵，與特異的蛋白質(zhì)相互作用，行使特殊的功能。 泛素的功能位點(diǎn)是 C末端，用以結(jié)合蛋白質(zhì)，而其 Lys48則作為其它泛素的結(jié)合位點(diǎn)，用以形成泛素鏈。 蛋白酶體 泛素 蛋白酶體系統(tǒng)的作用途徑 Western blotting 顯示泛素化帶型 Sumoylation SUMO化蛋白 SUMO (small ubiquitinrelated modifier) 是一種小的泛素相關(guān)修飾蛋白，它與泛素在序列上雖只有 18％相同，但在二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上有驚人的相似。 在體內(nèi) ， 甘氨酸殘基很容易被 C－端水解酶分解 。 IκB的降解使得 NFκB的入核序列暴露 ，從而進(jìn)入細(xì)胞核激活 NFκB的靶基因 。 3，磷酸化促使反式激活結(jié)構(gòu)域與阻遏蛋白解離，或促進(jìn)其與 DNA結(jié)合。由于磷酸化的片段上多了磷酸基團(tuán)，因此其分子量將比為被磷酸化的片段要大，由此可分析出磷酸化的位臵。 ? 蛋白去乙?；?HDACs可移去 H3 H4賴氨酸上的乙?；?，使帶正電荷的賴氨酸殘基暴露，從而增強(qiáng)與 DNA的相互作用。 由于 NTF2與 RanGTP無親合力 ， 這樣 RanGTP就可以釋放在細(xì)胞核中 。 CAS：輸出受體 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控 ◆ NLS的磷酸化 : casein kinase II對(duì) NLS磷酸化有利于蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn) 。 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控 開展科學(xué)研究的幾點(diǎn)思考 ? 搞科研一定有創(chuàng)新精神！ （仔細(xì)觀察） ? 搞科研一定要有連續(xù)性和系統(tǒng)性！ ? 搞科研一定要多看、多問、多動(dòng)手、 多思考！ （閱讀文獻(xiàn)，討論，提問題） ? 搞科研一定要耐得住寂寞！ （不急于開題） ? 搞科研一定要要踏踏實(shí)實(shí)！ （ 實(shí)驗(yàn)基本功 ） ? 搞科研一定要持之以恒！ 方法 態(tài)度 科學(xué)研究的策略 ? 發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象 ? 分析作用機(jī)理 ? 闡釋生物學(xué)功能 在分子、細(xì)胞、動(dòng)物、臨床水平開展研究 生物學(xué)功能與生理現(xiàn)象結(jié)合 結(jié)構(gòu)與功能結(jié)合 一個(gè)結(jié)論要用不同的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)