現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究方法學(xué)生-文庫吧在線文庫
【正文】 3，觀察樣品表面 蛋白修飾 ? 泛素化 (ubiquitination) ? 類泛素化 (sumoylation) ? 甲基化 (methylation) ? 乙?；? (acetylation) ? 磷酸化 (phosphorylation) …………… 國家自然科學(xué)基金 國家“ 973” 重大研究計劃 研究的必要性和重要性 蛋白質(zhì)是基因功能的實施者，蛋白質(zhì)的定位、翻譯后修飾及蛋白質(zhì) 蛋白 質(zhì)相互作用決定了蛋白質(zhì)的功能，也為研究細(xì)胞生長，分化和凋亡及重大疾 病發(fā)生和發(fā)展提供了基礎(chǔ)。 比較人與酵母的泛素序列，只有 3個氨基酸不同。 蛋白酶體（ 26s）包括一個 20s的中心顆粒和一個 19s的調(diào)節(jié)顆粒，在20s顆粒中心由七個亞基的四個環(huán)組成一個中空室。這段序列緊緊的塞在泛素的一個 superfold中 ， 還有一個高度靈活的 N端在類似泛素的中心突出 。 IκB是 NFκB的抑制因子 ， NFκB在胞漿中由于和 IκB結(jié)合呈現(xiàn)無活性的狀態(tài) 。 機理： 1，磷酸化增加了反式作用因子的反式激活結(jié)構(gòu)域與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件或轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物之間的親和力。 5，蛋白因子上被修飾的氨基酸殘基不同，對轉(zhuǎn)錄因子功能的影響也不同。 ? 阻礙去乙?；傅墓δ?，則可抑制癌細(xì)胞的增殖和分化，可用于急性早幼粒細(xì)胞性白血病 , 急性淋巴細(xì)胞性白血病和非何杰金氏淋巴瘤的治療。 為蛋白轉(zhuǎn)運提供能量 Ran GTP Ran是一種核蛋白 ， 分子量為 25KD， 通過與不同的效應(yīng)蛋白共同作用而相互調(diào)控 。 核轉(zhuǎn)運因子 2 (NTF2) RanGEF（鳥嘌呤核苷交換因子），它將 Ran上的 GDP替換成 GTP。 ◆ 核孔復(fù)合體裝臵 ：生長抑制期的細(xì)胞核孔通道有效直徑明顯低于細(xì)胞增殖期的有效直徑；在增殖細(xì)胞核中 ， 核孔通透性或核孔數(shù)目也不同于生長抑制期的細(xì)胞 。 ◆ 抑制蛋白的調(diào)節(jié) : 一些轉(zhuǎn)錄因子與抑制蛋白結(jié)合時，其 NLS被遮蔽，因而不發(fā)生核轉(zhuǎn)運而滯留在胞漿。在細(xì)胞核中， RanGTP 和 importin?相互作用，使輸入蛋白解體。 蛋白乙?；淖饔? Motif: GK, SK 蛋白轉(zhuǎn)運和分布研究 Protein translocation Protein shuttling Protein traffic 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程 ? 靶向 (targeting) ? 去折疊 ? 分子識別 ? 跨膜轉(zhuǎn)運 ? 分選和定位 (sorting and localization) ? 重折疊 ? 組裝 （在去折疊和重折疊中還有分子伴侶 (molecular chaperone)的參與 ) 靶向運送的信息來自于： 1, 信號肽 (也包括靶向線粒體的導(dǎo)肽 leader sequence) 2, 運送蛋白質(zhì)分子本身的某些片段 如 nuclare export sequence nuclear location sequence 3, 分泌蛋白自身的信息 蛋白質(zhì) 細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞核 蛋白質(zhì)的合成是在核糖體上進行的，但是合成后的蛋白質(zhì)必須定向的、準(zhǔn)確無誤地運送到特定的細(xì)胞器和細(xì)胞核中，才能保證細(xì)胞活動的正常進行。 ? CBP/p300可抑制腫瘤的形成，在小鼠瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) CBP突變，在結(jié)腸和乳房瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn) p300突變。 蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)控機理和特點 特點： 1，迅速。 IκB NFκB SUMO Ubiquitination TNF NFκB IκB Three 在許多蛋白特別是轉(zhuǎn)錄因子中都存在磷酸化和去磷酸化作用。在這一酯基反應(yīng)中， SUMO被轉(zhuǎn)移到 E2連接酶 UBC9上； UBC9與 SUMO硫脂的結(jié)合促進 SUMO的碳端和底物蛋白的 Lys殘基形成一個牢固的異肽結(jié)合。它們廣泛存在于原生動物、后生動物、植物和真菌中，顯示了 SUMO在進化上的保守性。 ? 泛素 結(jié)合酶 (UbiquitinConjugating Enzyme, E2)：分子量較小 ， 都有一個UBC結(jié)構(gòu)域 ， 可特異識別泛素 ， 并與泛素結(jié)合 ， 同時還具有識別 E3的功能 。因此， 只有系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的定位、翻譯后修飾及 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用的規(guī)律，才能從真正意義上闡明一個蛋白質(zhì)的 功能，才有可能研究細(xì)胞中某一生理活動中相關(guān)功能蛋白質(zhì)的作用及機制 。 4，與其它附件，如能譜、掃描等相連接，拓展了儀器的分析功能 . 不足： 1，樣品制備技術(shù)繁瑣 。 antibodyantigen, receptorligand, DNADNA, DNAprotein, proteinsmall molecular etc. 全自動，高通量，實時檢測，快速分析生物分子之間的相互作用 。 ? 根據(jù)蛋白質(zhì)的 cDNA序列的測定，推斷出蛋白質(zhì)分子的序列。所以細(xì)胞表現(xiàn)出不同的熒光值。分子運動包括膜或活細(xì)胞內(nèi)用熒光標(biāo)明的分子的擴散、轉(zhuǎn)移或其他類型的運動。 DNA affinity purification assay （ DAPA） ? 合成擬分析的 DNA片段，在 DNA片段的末端接上biotin作為探針與核蛋白孵育，再與能耦合生物素的瓊脂糖珠子免疫沉淀，最后利用 western blot的方式分析，從而獲得與 DNA探針相互作用的蛋白質(zhì)信息。 BIAcore生物分子相互作用分析（ Biomolecular Interaction Analysis） ? 基于表面等離子體共振（ SPR）來實時跟蹤生物分子間的相互作用的技術(shù)。如果以內(nèi)源的一些參照為標(biāo)準(zhǔn)，還可以用于研究細(xì)胞內(nèi)特定基因的 mRNA的表達(dá)水平。 關(guān)鍵點： mRNA，相關(guān)引物， PCR儀 不足：只能相對定量，不能 絕對定量 （ reverse transcriptionpolymerase chain reaction) Realtime PCR ? 實時定量 PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的基因定量檢測技術(shù)，它通過 PCR擴增中 Tag酶的 5’ － 3’ 的核酸外切酶活性，可以將標(biāo)記在探針上的熒光基團一淬滅基團分離，使熒光基團脫離淬滅基團的控制，從而產(chǎn)生熒光發(fā)射。 ? 被廣泛應(yīng)用于各類生物體系的測定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞。 蛋白標(biāo)記和定位 熒光顯微鏡技術(shù) ? 不同熒光素的激發(fā)光波長范圍是不同的 ， 所以同一樣品可以同時用兩種以上的熒光素標(biāo)記 。 光漂白中的熒光損失 (FLIP) ? 光漂白中的熒光損失：是一個鄰近重復(fù)漂白區(qū)的被定義區(qū)域內(nèi)熒光的減少或消失。 流式細(xì)胞術(shù)定量蛋白表達(dá)量 限制：僅用于膜蛋白含量的檢測。 ? 質(zhì)譜分析 ：通過酶解產(chǎn)生
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