現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究方法學(xué)生(已修改)
2025-01-28 10:33 本頁(yè)面
【正文】 現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué) 研究方法 吳 喬 Add：生物館 II 322 Tel： 2187959 基因研究的各種方法 Northern blotting 關(guān)鍵點(diǎn)： DNA探針， 標(biāo)記試劑盒（同位素和 非同位素）；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 優(yōu)點(diǎn)：特異性和敏感性高 缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)繁瑣，同位素 基因水平的檢測(cè) 同位素標(biāo)記細(xì)胞中的受體基因表達(dá)水平 RTPCR ? RTPCR主要由兩大步驟組成，一是反轉(zhuǎn)錄（ RT），二是 PCR。它與普通 PCR的區(qū)別就在于它是以 mRNA為最初始的模板。 ? RTPCR的用途很廣泛，既可以用來(lái)構(gòu)建 cDNA文庫(kù)，也可以獲得感興趣的基因的 cDNA序列。如果以內(nèi)源的一些參照為標(biāo)準(zhǔn)，還可以用于研究細(xì)胞內(nèi)特定基因的 mRNA的表達(dá)水平。 關(guān)鍵點(diǎn)： mRNA，相關(guān)引物， PCR儀 不足：只能相對(duì)定量，不能 絕對(duì)定量 （ reverse transcriptionpolymerase chain reaction) Realtime PCR ? 實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的基因定量檢測(cè)技術(shù)，它通過(guò) PCR擴(kuò)增中 Tag酶的 5’ － 3’ 的核酸外切酶活性，可以將標(biāo)記在探針上的熒光基團(tuán)一淬滅基團(tuán)分離，使熒光基團(tuán)脫離淬滅基團(tuán)的控制，從而產(chǎn)生熒光發(fā)射。通過(guò)熒光吸收裝臵檢測(cè)發(fā)出熒光的多少來(lái)反映模板量的高低，從而達(dá)到實(shí)時(shí)定量的目的。 ? 關(guān)鍵點(diǎn)：引物設(shè)計(jì)， realtime PCR儀 倍數(shù)差 原位雜交定位基因的表達(dá) 1， 組織 /細(xì)胞固定 脫水 石蠟包埋 切片 2， DNA 探針的制備（地高辛或同位素標(biāo)記） 3，探針標(biāo)記 mRNA顯示 mRNA 4，顯微鏡觀察 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的 DNA 探針；地高辛試劑盒或同位素，切片機(jī)；對(duì)照組的設(shè)臵 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 KAI1 RNA干擾技術(shù) ? 發(fā)現(xiàn)者獲得諾貝爾獎(jiǎng)； ? RNA干擾 (RNA interference， RNAi)是一種可以在細(xì)胞內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象。它由雙鏈 RNA產(chǎn)生，可以特異性地降解具有相同或者相似序列的 RNA（包括 mRNA）。它是一種比反義技術(shù)更為有效的方法，具有更高的特異性。 關(guān)鍵點(diǎn)：確定 19－ 21寡核苷酸（一條基因上有許多條候選 寡核苷酸） ，cDNA轉(zhuǎn)錄成 mRNA的試劑盒（效果好但價(jià)格貴），或表達(dá)載體 pSuper, 轉(zhuǎn)染試劑盒；要設(shè)臵好對(duì)照（不相關(guān)的序列） 不足：干擾不夠穩(wěn)定、不完全，不能長(zhǎng)時(shí)間作用 ? 熒光酶基因（ Luc）是從螢火蟲(chóng) cDNA文庫(kù)中克隆的 ? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織沒(méi)有任何內(nèi)源性熒光素酶活力，所以 Luc可作為非常靈敏的遺傳報(bào)告基因 ? 熒光酶報(bào)告基因具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、費(fèi)用低、用途廣、可定量等優(yōu)點(diǎn) 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) （熒光素酶檢測(cè)方法） 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) （熒光素酶檢測(cè)方法） 關(guān)鍵點(diǎn)： Luciferase報(bào)告基因，表達(dá)載體， ?gal, 轉(zhuǎn)染效率，熒光檢測(cè)儀 基因芯片分析 ? 設(shè)臵好對(duì)照組，取樣（ mRNA） ? 由公司測(cè)定，提供基因檢測(cè)結(jié)果（根據(jù)細(xì)胞功能分類） ? 排除變化相同的基因 ? 確定變化差異的基因 ? 選擇感興趣的基因進(jìn)一步證實(shí)它們的變化 ? 該方法特別適合用于信號(hào)通路中新的下游靶基因的發(fā)現(xiàn) 蛋白研究的各種方法 Western blotting 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的抗體； ECL顯示試劑；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 不同抗體差別很大：用量、效果、特異性 使用的電泳膠的濃度與蛋白的分子量密切相關(guān) （反比關(guān)系） 優(yōu)點(diǎn)：可用于定量分析 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 蛋白半衰期 CHX(cycloheximide) 放線菌酮 有的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的半衰期很短 CHX的作用是抑制新蛋白的合成 免疫組織化學(xué)方法顯示蛋白 1， 組織 /細(xì)胞固定 脫水 石蠟包埋 切片 2，免疫組化染色 3，顯微鏡觀察 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的抗體；切片機(jī)； 對(duì)照組的設(shè)臵 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 蛋白的相互作用和 蛋白與 DNA的結(jié)合分析 免疫沉淀 /免疫印跡 (CoIP) Immunoprecipitation/Western blot ? 用特異性抗體結(jié)合細(xì)胞裂解液中的某個(gè)目的蛋白質(zhì) （ 即免疫沉淀 ） ， 洗滌后解離特異性抗體和目的蛋白質(zhì) ， 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） ， 最后用 Western blot 分析顯示另一個(gè)目的蛋白質(zhì) 。 這種方法可以分析溶液中 、 細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白 ， 但只能是定性或半定量的實(shí)驗(yàn) 。 BIAcore生物分子相互作用分析（ Biomolecular Interaction Analysis） ? 基于表面等離子體共振（ SPR）來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤生物分子間的相互作用的技術(shù)。 ? 被廣泛應(yīng)用于各類生物體系的測(cè)定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞。 ? 具有高天然性、高效率、高靈敏度、樣品量少、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，但儀器昂貴、不易操作、價(jià)格高。 凝膠阻抑實(shí)驗(yàn) （ Gel retardation assay） ? 當(dāng) DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)的 DNA片段或寡核苷酸結(jié)合而形成 DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物后，使 DNA片段的分子量及電荷發(fā)生改變，因而在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中其電泳遷移率發(fā)生改變，通常較游離的DNA片段的泳動(dòng)速率慢得多，在X光膠片上形成一較游離 DNA片段滯后的帶型。 ? ?實(shí)驗(yàn)過(guò)程： DNA片段 (probe)進(jìn)行末端標(biāo)記（同位素、生物素或熒光） ?probe與核蛋白孵育 電泳 干膠 曝光 染色質(zhì)免疫共沉淀 （ ChIP） ? 利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的 DNA片段沉淀下來(lái)。通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA相互作用的信息。 ? ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)蛋白與 DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。 ? ChIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍： CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的 ChIPonchip 方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量 篩選； ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找 反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)； RNAChIP用于研 究 RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。 DNA affinity purification assay （ DAPA） ? 合成擬分析的 DNA片段，在 DNA片段的末端接上biotin作為探針與核蛋白孵育，再與能耦合生物素的瓊脂糖珠子免疫沉淀，最后利用 western blot的方式分析，從而獲得與 DNA探針相互作用的蛋白質(zhì)信息。 蛋白標(biāo)記和定位 熒光顯微鏡技術(shù)
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