【正文】 CAS：輸出受體 蛋白轉(zhuǎn)運調(diào)控 ◆ NLS的磷酸化 : casein kinase II對 NLS磷酸化有利于蛋白的入核轉(zhuǎn)運 。 ? 蛋白去乙酰化酶 HDACs可移去 H3 H4賴氨酸上的乙?；箮д姾傻馁嚢彼釟埢┞?，從而增強與 DNA的相互作用。 3，磷酸化促使反式激活結(jié)構(gòu)域與阻遏蛋白解離，或促進(jìn)其與 DNA結(jié)合。 在體內(nèi) ， 甘氨酸殘基很容易被 C－端水解酶分解 。 泛素的功能位點是 C末端，用以結(jié)合蛋白質(zhì)，而其 Lys48則作為其它泛素的結(jié)合位點，用以形成泛素鏈。 2，樣品室往多功能發(fā)展 。 ? JC－ 1特異地與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，只在線粒體膜電位崩解的時候才釋放出來，因此，檢驗結(jié)果可靠，敏感性高。 ? FRAP是由沒有漂白的熒光團從周圍進(jìn)入漂白區(qū)的運動引起的。 關(guān)鍵點：確定 19－ 21寡核苷酸（一條基因上有許多條候選 寡核苷酸） ，cDNA轉(zhuǎn)錄成 mRNA的試劑盒（效果好但價格貴），或表達(dá)載體 pSuper, 轉(zhuǎn)染試劑盒；要設(shè)臵好對照（不相關(guān)的序列） 不足：干擾不夠穩(wěn)定、不完全，不能長時間作用 ? 熒光酶基因（ Luc）是從螢火蟲 cDNA文庫中克隆的 ? 哺乳動物細(xì)胞和組織沒有任何內(nèi)源性熒光素酶活力，所以 Luc可作為非常靈敏的遺傳報告基因 ? 熒光酶報告基因具有檢測速度快、靈敏度高、費用低、用途廣、可定量等優(yōu)點 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測 （熒光素酶檢測方法） 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測 （熒光素酶檢測方法） 關(guān)鍵點： Luciferase報告基因，表達(dá)載體， ?gal, 轉(zhuǎn)染效率，熒光檢測儀 基因芯片分析 ? 設(shè)臵好對照組，取樣（ mRNA） ? 由公司測定，提供基因檢測結(jié)果（根據(jù)細(xì)胞功能分類） ? 排除變化相同的基因 ? 確定變化差異的基因 ? 選擇感興趣的基因進(jìn)一步證實它們的變化 ? 該方法特別適合用于信號通路中新的下游靶基因的發(fā)現(xiàn) 蛋白研究的各種方法 Western blotting 關(guān)鍵點：相應(yīng)的抗體； ECL顯示試劑；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 不同抗體差別很大：用量、效果、特異性 使用的電泳膠的濃度與蛋白的分子量密切相關(guān) （反比關(guān)系） 優(yōu)點：可用于定量分析 蛋白表達(dá)水平的檢測 蛋白半衰期 CHX(cycloheximide) 放線菌酮 有的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的半衰期很短 CHX的作用是抑制新蛋白的合成 免疫組織化學(xué)方法顯示蛋白 1， 組織 /細(xì)胞固定 脫水 石蠟包埋 切片 2，免疫組化染色 3，顯微鏡觀察 關(guān)鍵點：相應(yīng)的抗體；切片機； 對照組的設(shè)臵 對照組 實驗組 蛋白的相互作用和 蛋白與 DNA的結(jié)合分析 免疫沉淀 /免疫印跡 (CoIP) Immunoprecipitation/Western blot ? 用特異性抗體結(jié)合細(xì)胞裂解液中的某個目的蛋白質(zhì) （ 即免疫沉淀 ） ， 洗滌后解離特異性抗體和目的蛋白質(zhì) ， 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） ， 最后用 Western blot 分析顯示另一個目的蛋白質(zhì) 。 ? 關(guān)鍵點：引物設(shè)計， realtime PCR儀 倍數(shù)差 原位雜交定位基因的表達(dá) 1， 組織 /細(xì)胞固定 脫水 石蠟包埋 切片 2， DNA 探針的制備（地高辛或同位素標(biāo)記） 3，探針標(biāo)記 mRNA顯示 mRNA 4，顯微鏡觀察 關(guān)鍵點：相應(yīng)的 DNA 探針；地高辛試劑盒或同位素，切片機；對照組的設(shè)臵 對照組 實驗組 KAI1 RNA干擾技術(shù) ? 發(fā)現(xiàn)者獲得諾貝爾獎； ? RNA干擾 (RNA interference， RNAi)是一種可以在細(xì)胞內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象。 熒光顯微鏡中只有激發(fā)熒光可以成象 ， 因為產(chǎn)生激發(fā)光的光全被樣品與照相機之間的濾光片吸收 。 蛋白表達(dá)量以面積表示。 ? AFM對于生物系統(tǒng)的成像分析比光學(xué)顯微鏡具有更高的分辨率 （ 大約可以到 1nm） ， 比電鏡觀察所需要的樣品處理更接近于生理條件 ， 并且比光譜學(xué)技術(shù) （ 通常需要從大量光譜信號中間接推導(dǎo)出結(jié)構(gòu)信息 ） 更直觀 。目前發(fā)現(xiàn)所有生物的泛素都是由氨基酸編碼的，而且序列相當(dāng)保守。 SUMO1的三級結(jié)構(gòu)包括一個與泛素同源區(qū)域（ 氨基酸序列 22－ 97） 。 3）調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)與其他因子的作用。 MeCP2突變導(dǎo)致 Rett綜合征，患者出生即發(fā)病、智力發(fā)育遲緩、伴孤獨癥。 在胞漿中， RanGTP在 RanGAP/RanBP1的協(xié)助下轉(zhuǎn)換為 RanGDP，然后重新通過 NTF2的介導(dǎo) 進(jìn)行新一輪的蛋白轉(zhuǎn)運。例如： NFKB與其抑制蛋白 IKB NLS的 C端也可能發(fā)生自身折疊而發(fā)生遮蔽效應(yīng)。 蛋白入核轉(zhuǎn)運 ? 分子量小于 4550KD的蛋白：在不需要外界能量供應(yīng)的前提下可以通過核孔自由進(jìn)出（被動擴散）； ? 分子量大于 50KD的蛋白：①依賴于能量和溫度；②需要胞漿運輸因子；③需要核孔復(fù)合體蛋白（主動運輸）； 核定位序列 （ nuclear localization sequence, NLS） ? ① 單一型 NLS，由一段連續(xù)的堿性氨基酸順序排列而成 （ RKKKRKV） ? ②雙分型 NLS，由兩簇堿性氨基酸被中間 10－ 12個非保守性氨基酸所分隔而形成 （ KRPAATKKAGQAKKKKLDK） protein importin? protein importin? importin? protein importin? importin? cytoplasm NPC importin? protein importin? Nucleus nucleoprotin IBB IBB GTPase Ran/TC4 蛋白出核轉(zhuǎn)運 核輸出序列（ nuclear exporting sequence, NES） F X表示任意氨基酸 I I X2－ 3表示 2－ 3個任意氨基酸 L X25 L X23 – L L L 亮氨酸 V V 頡氨酸 M甲硫氨酸 M F 苯丙氨酸 I 異亮氨酸 其特征是富含亮氨酸（ Leu），但與 NLS無任何同源性 。 2，激酶催化的磷酸化可以被磷酸酶所逆轉(zhuǎn)。有的 SUMO底物蛋白需要 E3聯(lián)接酶來促進(jìn)它們的 SUMO化 ,有的不需要 E3。 ? 泛素 蛋白連接酶 (UbiquitinProtin Ligases, E3)：一類大分子蛋白質(zhì) ， 結(jié)構(gòu)復(fù)雜 ， 主要作用是特異識別靶蛋