現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究方法學(xué)生(完整版)
【正文】 肽段片段，通過質(zhì)譜儀分析肽指紋圖譜，從而獲得氨基酸序列，再與網(wǎng)上蛋白庫匹配，來確定是已知還是未知蛋白。 相互作用分析包括：分子結(jié)合定量分析 , 動(dòng)力學(xué)和親和性分析，結(jié)合能力和協(xié)同性分析（結(jié)合速率 Ka，解離速率Kd，結(jié)合常數(shù) KD） 不用對(duì)樣品作任何標(biāo)記和修飾 圓二色譜分析蛋白構(gòu)象改變 旋光值計(jì)算： 分子對(duì)接模擬預(yù)測(cè)化合物與蛋白結(jié)合的模型 O HH O OOOKd= ?M O HH O OOKd: ND A320nmR adius (cm) Comp o u n d B T R3 A320nmR adius (c m) TR 3 + C o m p o u n d B6. 95 7. 00 7. 05 7. 100. 00. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 7 A320nmR a dius (c m ) Com po un d B G ST G ST+ Com po un d B A280nmR a dius (c m ) Co m po un d B TR3 TR3 + Com po un d B分析超離方法檢測(cè)化合物與蛋白的相互作用 原子力顯微鏡 (AFM) ? 優(yōu)點(diǎn)： 1)原子力顯微鏡作為掃描探針顯微鏡的一種 ， 可觀察生物形態(tài)結(jié)構(gòu) 。 2，對(duì)單個(gè)原子顯微觀察不理想 。 蛋白降解的系統(tǒng) 溶酶體蛋白溶解系統(tǒng) 非溶酶體蛋白溶解系統(tǒng) 泛素 — 蛋白酶系統(tǒng) 鈣依賴性的 蛋白溶解系統(tǒng) 泛素、 26s蛋白酶體、 酶系統(tǒng) (E E E E4 、 泛素 C— 末端水解酶 ) 普遍存在于原核生物和真核生物細(xì)胞中，是真核細(xì)胞內(nèi)最重要的非溶酶體性的蛋白溶解系統(tǒng) 主要功能是降解機(jī)體正常情況下特 別是應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的異常細(xì)胞漿 內(nèi)短壽命蛋白質(zhì)，包括一些重要的 調(diào)節(jié)蛋白如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào) 節(jié)因子和信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子等。 ? 泛素 蛋白連接酶 (UbiquitinProtin Ligases, E3)：一類大分子蛋白質(zhì) ， 結(jié)構(gòu)復(fù)雜 ， 主要作用是特異識(shí)別靶蛋白 ， 并將其傳遞給蛋白酶體降解 。 SUMO家族成員都有獨(dú)特的 N端氨基酸序列和碳端外延序列。有的 SUMO底物蛋白需要 E3聯(lián)接酶來促進(jìn)它們的 SUMO化 ,有的不需要 E3。 轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化、去磷酸化可能影響： 1）轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)或相反。 2，激酶催化的磷酸化可以被磷酸酶所逆轉(zhuǎn)。 ? 如果突變導(dǎo)致錯(cuò)誤的激活去乙酰化酶或錯(cuò)誤的和去乙?；赶嗷プ饔?，將可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。 蛋白入核轉(zhuǎn)運(yùn) ? 分子量小于 4550KD的蛋白：在不需要外界能量供應(yīng)的前提下可以通過核孔自由進(jìn)出（被動(dòng)擴(kuò)散）； ? 分子量大于 50KD的蛋白：①依賴于能量和溫度；②需要胞漿運(yùn)輸因子；③需要核孔復(fù)合體蛋白（主動(dòng)運(yùn)輸）； 核定位序列 （ nuclear localization sequence, NLS） ? ① 單一型 NLS，由一段連續(xù)的堿性氨基酸順序排列而成 （ RKKKRKV） ? ②雙分型 NLS，由兩簇堿性氨基酸被中間 10－ 12個(gè)非保守性氨基酸所分隔而形成 （ KRPAATKKAGQAKKKKLDK） protein importin? protein importin? importin? protein importin? importin? cytoplasm NPC importin? protein importin? Nucleus nucleoprotin IBB IBB GTPase Ran/TC4 蛋白出核轉(zhuǎn)運(yùn) 核輸出序列（ nuclear exporting sequence, NES） F X表示任意氨基酸 I I X2－ 3表示 2－ 3個(gè)任意氨基酸 L X25 L X23 – L L L 亮氨酸 V V 頡氨酸 M甲硫氨酸 M F 苯丙氨酸 I 異亮氨酸 其特征是富含亮氨酸（ Leu），但與 NLS無任何同源性 。此時(shí) importin?則自由地結(jié)合到其輸出受體 CAS上， CAS和 RanGTP再相互作用形成三聚體復(fù)合物，被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿，由此重新 importin ? cycle。例如： NFKB與其抑制蛋白 IKB NLS的 C端也可能發(fā)生自身折疊而發(fā)生遮蔽效應(yīng)。 ◆ 胞漿錨定機(jī)制 ：在爪蟾卵細(xì)胞 xnf7蛋白中 ， 有一胞漿滯留區(qū) （ CRD） ，具有很強(qiáng)的錨定功能；只有當(dāng) CRD序列上的 P34cdc2位點(diǎn)脫磷酸化后引起 CRD失活 ， 其錨定功能喪失 ， xnf7蛋白才能夠轉(zhuǎn)運(yùn)入核 。 在胞漿中， RanGTP在 RanGAP/RanBP1的協(xié)助下轉(zhuǎn)換為 RanGDP，然后重新通過 NTF2的介導(dǎo) 進(jìn)行新一輪的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。 為出核過程提供能量的仍然是 NPC上的 GTPase Ran/TC4。 MeCP2突變導(dǎo)致 Rett綜合征，患者出生即發(fā)病、智力發(fā)育遲緩、伴孤獨(dú)癥。 4，同一種激酶或磷酸酶都是多底物的，對(duì)不同轉(zhuǎn)錄因子的影響不同。 3）調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)與其他因子的作用。 SUMO的生物學(xué)功能 1, 調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用 2, 調(diào)節(jié)蛋白在核漿間的轉(zhuǎn)運(yùn) 3, 調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性 4, 拮抗泛素化，使蛋白穩(wěn)定 IκB是 SUMO的一個(gè)底物蛋白 ， 它 既能發(fā)生 SUMO化 ， 又能發(fā)生泛素化 ， 而且由于 SUMO化和泛素化的位點(diǎn)都是 K21, SUMO會(huì)和泛素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn) 。 SUMO1的三級(jí)結(jié)構(gòu)包括一個(gè)與泛素同源區(qū)域（ 氨基酸序列 22－ 97） 。 泛素 C末端水解酶（ UCHs） UCHs多為含巰基蛋白酶，分子量大小不等，能特異識(shí)別泛素 C末端區(qū)域，解離泛素與靶蛋白的結(jié)合 , 促進(jìn)泛素再循環(huán)，所以對(duì)泛素系統(tǒng)的正常運(yùn)行很必要。目前發(fā)現(xiàn)所有生物的泛素都是由氨基酸編碼的，而且序列相當(dāng)保守。 4，樣品是“ 死”的 . 掃描電子顯微鏡 優(yōu)點(diǎn)： 1，樣品制作較簡(jiǎn)便 2，樣品可動(dòng)自由度大 3，圖像富有立體感 4，放大范圍廣 5，可從
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