【正文】 處死應(yīng)以安樂死為原則，即使之無痛苦而迅速死亡。 2．捉拿及處死方法： 常用搗髓法處死蟾蜍，即用解剖針搗毀其腦組織和脊髓。九、有不遵守上述要求者，任課老師將終止其實驗，并取消其當(dāng)堂實驗成績。要愛護儀器、標(biāo)本和設(shè) 備。由于經(jīng)驗不足，水平有限，本教材一定還有很多缺點和錯誤，敬請使用者批評指正。為達到此目的，實驗內(nèi)容自成體系，著眼于加強學(xué)生的基末技能訓(xùn)練，以及觀察分析問題和科學(xué)思維能力的培養(yǎng)。 全書內(nèi)容共23個實驗，五年制本科、七年制醫(yī)學(xué)專業(yè)和研究生班教學(xué)根據(jù)具體情況選擇基本實驗，由學(xué)生自己動手操作，少數(shù)應(yīng)用大型精密儀器的實驗進行參觀示教，另附實驗報告一冊。 二、進入實驗室之前要換好白大衣及拖鞋。 六、注意節(jié)約實驗材料、藥品和水、電等。例如，蟾蜍可以用于觀察離體心臟搏動情況的實驗，小白鼠常用于樣本很大的實驗(如藥物的半數(shù)致死量的測定等)，貓常用于測定腦內(nèi)電位的實驗，而狗是局解手術(shù)中常用的實驗動物。然后將解剖針抽回并轉(zhuǎn)向尾側(cè)刺入脊椎管內(nèi)搗毀其脊髓。頸椎脫位法的具體方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的頭部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其頸椎脫位而立即死亡。常用來搗髓處死蟾蜍，持法如執(zhí)筆法。 6．鈍頭鑷子：用于提取臟器、組織等。【實驗用品】一、材料和標(biāo)本 蟾蜍一只，人血液一滴。 (二)觀察方法與結(jié)果 1．制備蟾蜍脊髓壓片觀察脊髓前角運動神經(jīng)細胞。盡可能拉直肌纖維。(圖l一1)。顯微鏡下觀察可見復(fù)蓋口腔表面的上皮細胞為扁平橢圓形，中央有橢圓形核，染成蘭色?！咀? 業(yè)】 一、分別求出使用低倍鏡(10X)，高倍鏡(40X)時目鏡測微尺每格代表的長度： 低倍鏡：目鏡測微尺每格代表的長度= XlO(μm)= μm 高倍鏡：目鏡測微尺每格代表的長度= XlO(μm)= μm 二、分別繪制所觀察的6種細胞并注明基本結(jié)構(gòu)?；铙w染色是應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細胞生命活動的一種染色方法。 二、線粒體的光鏡切片觀察 用詹納斯綠B染色的兔肝細胞光鏡切片，肝細胞中的線粒體呈藍綠色的顆粒。 這有三張線粒體超薄切片的電鏡照片：第一張是小鼠腎小管上皮細胞中線粒體的電鏡照片，可見線粒體呈橢圓形和桿狀，由雙層膜包圍，內(nèi)膜向內(nèi)突起成平板狀脊，脊與線粒體長軸垂直排列，腎小管上皮細胞重吸收作用需要能量，線粒體數(shù)目多。三、試劑 l／3000中性紅染液、Ringer氏液(兩棲類用)?！咀? 業(yè)】繪制光鏡下軟骨細胞液泡系。2．在有兩片的平皿內(nèi)加100μg／ml的細胞松弛素B 4滴繼續(xù)培養(yǎng)半小時。 ④將蓋片移入3％戊二醛固定15分鐘。在麗藻細胞中的微絲與胞質(zhì)環(huán)流有密切關(guān)系。 三、微絲的電鏡照片觀察 恒河猴脊髓內(nèi)神經(jīng)纖維中微絲電鏡照片，可見微絲是實心結(jié)構(gòu)，直徑5～8cm，它均勻地分散于細胞基質(zhì)中，或排列成束和網(wǎng)狀。在低倍鏡卡觀察，染成藍色的大三角形、星形細胞就是脊髓前角神經(jīng)細胞，染色較深的小細胞為神經(jīng)膠質(zhì)細胞。 (二)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum) 人胃壁細胞、恒河猴脊髓前角運動神經(jīng)細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)電鏡照片：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在分泌蛋白質(zhì)的細胞中較發(fā)達，在細胞核周圍可見有較密集的膜層結(jié)構(gòu)即為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，它們大都呈片狀排列，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可與細胞核膜相通連。 (六)細胞核(Cell Nucleus) 豚鼠肝細胞核、人胃癌細胞核電鏡照片：可見核膜由雙層單位膜構(gòu)成。細胞膜與核膜之間為細胞質(zhì)。 三、試劑 ％臺盼蘭、1％剛果紅。 (二)小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬活動的觀察 l．實驗前二天，每天向小鼠腹腔注射6％淀粉肉湯O．5～1ml(含O．3％臺盼蘭，起標(biāo)記作用)，以刺激腹腔產(chǎn)生較多的巨噬細胞(此步由教師在實驗前進行完畢)。 (二)自制遮光板變普通顯微鏡為“簡單的暗視野顯微鏡”。 2．腹部向上將蟾蜍固定在蠟盤上。 2．剪取一側(cè)精巢于盛有自來水的平皿中，用鑷子夾住精巢的一端，清洗去血污。身體的前部有口溝，由前端斜向伸至體中部，口溝的底部為胞口，下部一短管斜向后部而入胞質(zhì)，稱胞咽。 3．觀察草履蟲的食物泡的形成： 1)在蓋玻片一側(cè)加一滴l％的剛果紅指示劑，用吸水紙從另一側(cè)吸引使指示劑進入蓋片下方，選一運動較遲緩的草履蟲，移入高倍鏡觀察吞噬活動。 一、Brachet反應(yīng)一顯示細胞內(nèi)的DNA和RNA (一)原理 細胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后，其中的DNA和RNA出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng)，一般認為這是由于帶有負電荷的核酸對堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的DNA呈藍綠色，呱咯寧染低聚分子的RNA呈紅色。 6. 放入l／2丙酮+1／2二甲苯中5秒鐘。小心將心臟剪一小口，取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，按此法制備二張血涂片，室溫晾干。經(jīng)酸性固綠染色片中，因胞質(zhì)和核仁中有酸性蛋白，被染成綠色。7．鏡檢或封片后鏡檢。 5．直接浸入過碘酸酒精液反應(yīng)5～15分鐘，經(jīng)70％乙醇洗片刻。 (三)結(jié)果 細胞中呈紫紅的顆粒即為糖原(參照照片)。 勻漿(Homogenization)低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)(／／L氯化鈣)進行破碎細胞使之成為各種細胞器及其包含物的勻漿。 4．將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機，以2500rpm，離心15分鐘；(1)緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；(2)同時涂一張上清液片②做好標(biāo)記，自然干燥；(3)余下的沉淀物進行下一步驟。【作 業(yè)】 1．簡要說明分級分離細胞的原理及意義。其后無絲分裂又在各種動植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，尤其在分裂旺盛的細胞中更多見，但遺傳物質(zhì)平均分配否?及其分裂的機制尚不十分清楚。細胞膜的外面或卵殼的內(nèi)面可見有極體附著。 2．植物細胞有絲分裂的觀察——洋蔥根尖切片 將洋蔥根尖切片標(biāo)本先在低倍鏡下觀察，尋找生長區(qū)，這部分的細胞分裂旺盛，大多處于分裂狀態(tài)，細胞形狀呈方形。 3．固定 把取出的精巢立即放入Carnoy固定液中，固定1小時，在期間用大頭針小心分離精細管，加速固定，促進脂肪溶解。彎曲繞成一團，排列無規(guī)則，染色線上有大小不一的染色粒，形似念珠，核仁清楚。但每條染色體的著絲粒尚未分裂，故兩條姐妹染色單體仍連在一起同去一極。 4．精子形成 在兩次精母細胞分裂過程中，各種細胞器，如，線粒體、高爾基體等也大致平均地分到四個精細胞中，精細胞經(jīng)一系列的分化成熟為精子。無菌器材有培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、注射器(5ml、lml)、注射針頭(7號、 號)、刻度移液管(5ml、2ml、lml)、吸管等。因此它是細胞生物學(xué)及其它學(xué)科研究中的一種有效的方法。 4．在培養(yǎng)瓶上標(biāo)記好供血者姓名、性別、采血日期等，放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。用天平平衡后以1000rpm離心8分鐘，棄大部上清。斜放載玻片，在空氣中晾干(此期間配制Giemsa染液，Giemsa原液和磷酸緩沖液1:10)。 腫瘤細胞染色體制備技術(shù)在細胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床診斷、愈后觀察等方面均有廣泛用途。附：人體染色體常規(guī)核型的分析 一、人體染色體的觀察 取制備較好的染色體玻片標(biāo)本，先在低倍鏡下觀察。A組包括三對，即第1~3號6條染色體，第1號為最大、是中央著絲點，長臂近側(cè)有次縊痕；第2號第二大、著絲點略偏離中央；第3號為三大，是中央著絲點。 上述人的常規(guī)核型中，1～22號為常染色體，男女共有，另一對為性染色體，決定性別，男性為XY，女性為XX，人的正常核型寫法：男46，XY；女46，XX。目前應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇，因為它易得、簡便，且融合效果穩(wěn)定。此全部過程都要求在37℃水浴內(nèi)進行?！緦嶒炗闷贰? 一、材料 人宮頸癌上皮細胞(HeLa細胞) 二、器材和儀器 顯微鏡、離心機、水浴箱、熱吹風(fēng)機、10ml刻度離心管、5(1/2) 針頭注射器、試管架、染色槽、廢液缸、吸水紙、擦鏡紙、冰凍載玻片、香柏油瓶、記號筆、酒精燈。每組取一瓶經(jīng)上述處理的細胞，以平行于細胞生長面方向反復(fù)振搖，使培養(yǎng)液不斷沖涮細胞層(或用吸管吹打)，M期細胞因變成球形容易脫離瓶壁而懸浮。1000rpm離心5分鐘，去掉上清，再小心地吸盡殘液。 三、結(jié)果觀察 在低倍鏡下，可以容易地找到M期與I期細胞融合而誘導(dǎo)產(chǎn)生的PCC圖像，由于處于I期不同時相的細胞均能與M期細胞融合而被誘導(dǎo)產(chǎn)生PCC，因此有三種不同形態(tài)特點的提前凝集染色體：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。 (3)1000rpm離心5分鐘。然后加入5ml Hanks液。即讓M期細胞與間期（I期）細胞融合，從而誘導(dǎo)I期細胞染色質(zhì)提前濃縮成染色體。要注意辨別融合細胞與重疊的雞紅細胞。放入37℃水浴中待用?！緦嶒炗闷贰恳弧⒉牧? 雞紅細胞二、器材和儀器：顯微鏡、離心機、水浴箱、刻度離心管、試管、載玻璃片、蓋玻片三、試劑 50％PEG(MW4,000)、Hanks液()【實驗內(nèi)容】 一、原理 細胞融合(Cell fusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學(xué)的)使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的過程。Y染色體被隸屬于該組，短臂無隨體，一般較2l、22號大點。 二、核型分析的方法 人體染色體常規(guī)核型的分析，在今天的染色體研究水平上作為染色體結(jié)構(gòu)異常的疾病診斷已經(jīng)失去意義，但對染色體數(shù)目異常仍具有診斷上的價值，尤其是起著分析其它幾種顯帶核型的橋梁作用。按時終止培養(yǎng)，％％EDTA混合消化液處理單層細胞，待細胞收縮變圓時，棄去消化液。分區(qū)計數(shù)染色體數(shù)目并判定性別，或拍照后進行核型分析。 4．輕輕將細胞吹成懸液，加5~6ml固定液，室溫下固定30分鐘。接著進行固定并除去中期分裂相中殘存的蛋白質(zhì)，使染色體清晰且分散良好。用75％酒精棉球擦洗手、各種試劑瓶及操作臺面，然后將培養(yǎng)液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超凈臺。PHA(Phytohemagglutinin，植物血凝素)是人和其它動物淋巴細胞的有絲分裂刺激劑，它能使處于G0期的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，進入細胞周期開始旺盛的有絲分裂。(謝榮林編)實驗十 正常細胞與腫瘤細胞常規(guī)核型的標(biāo)本制備【實驗?zāi)康摹? 掌握微量全血培養(yǎng)及正常細胞和腫瘤細胞常規(guī)核型的標(biāo)本制備技術(shù)。 (1)前期Ⅱ(Prophase Ⅱ)末期I的細胞進入前期Ⅱ狀態(tài)，每條染色體的兩個單體顯示分開的趨勢，染色體象花瓣狀排列，使前期Ⅱ的細胞呈實心花狀。終變期(Diakinesis) 染色體更為粗短，形成Y、V、O等形狀，終變期末核膜、核仁消失。 (三)蝗蟲精子發(fā)生過程減數(shù)分裂的鏡下觀察(參照照片) 蝗蟲精巢是由多條圓柱形的精細管組成，每條精細管由于生殖細胞發(fā)育階段的差別可分成若干區(qū)，良好壓片可見到從游離的頂端起始依次為精原細胞、精母細胞、精細胞及精子等各發(fā)育階段的區(qū)域。 蝗蟲精巢取材方便，標(biāo)本制備方法簡單，染色體數(shù)日較少，例如，蝗蟲初級精母細胞染色體數(shù)2n=22+X，經(jīng)過減數(shù)分裂形成四個精細胞，每個精細胞的染色體數(shù)為n=ll+X或n=11(注：蝗蟲的性別決定與人類不同，雌性有兩條X染色體、雄性為XO，即只有一條X染色體，沒有Y染色體)，一般多采用它來研究觀察減數(shù)分裂染色體形態(tài)變化。 分裂期(Mitosis) 前期(Prophase)雌、雄原核相互趨近,染色質(zhì)逐漸濃縮變粗、核仁消失，最后核膜破裂、染色體相互混合，兩個中心粒分別向細胞兩極移動，紡錘體開始形成。有絲分裂過程包括一系列復(fù)雜的核變化，染包體和紡錘體的出現(xiàn)，以及它們平均分配到每個子細胞的過程。 二、器材和儀器 顯微鏡、擦鏡紙、解剖針、眼科鑷子、載玻片、蓋玻片、吸水紙、培養(yǎng)皿、冰箱。 三、高速離心分離提取線粒體 (一)操作步驟 1．將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000rpm離心20分鐘，棄上清，留取沉淀物。 分析 分級分離得到的組分，可用細胞化學(xué)和生化方法進行形態(tài)和功能鑒定。 二、器材和儀器 玻璃勻漿器、普通離心機、臺式高速離心機、普通天平、光學(xué)顯微鏡、載玻片、蓋玻片、刻度離心管、高速離心管、滴管、10ml量筒、25ml燒杯、玻璃漏斗、解剖剪、鑷子、吸水紙、紗布、螬盤、平皿、牙簽。 9．蒸餾水洗。 2．乙醇脫水、二甲苯透明。3．％硫酸銅中浸30秒~1分鐘。5．濾紙吸干玻片上水分。二、細胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示（一）原理由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團的數(shù)目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。 3．放入Carnoy固定液中固定l小時?！緦嶒炗闷贰? 一、材料和標(biāo)本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝臟石臘切片、培養(yǎng)的Hela細胞?？梢杂^察到消化過程。 2．置高倍鏡下觀察：可見有許多靠尾部鞭毛彎曲擺動驅(qū)使而運動的精子，測量鞭毛長度。 6．加一滴生理鹽水于載玻片標(biāo)本上，加蓋玻片，鏡檢。4．按照圖61的形狀，用黑紙剪成與調(diào)節(jié)后光圈孔徑一樣大小的中央遮光板。 5．鏡檢，高倍鏡下畫圖記錄所見結(jié)果。在白細胞中，以粒細胞、單核細胞的吞噬活動較強，故稱此二類細胞為吞噬細胞。在細胞質(zhì)中還可見一些不規(guī)則形的黑色致密結(jié)構(gòu)是脂褐質(zhì)，細胞質(zhì)基質(zhì)中分散存在纖細的微絲和微管是細胞骨架成份。 在核膜內(nèi)面和核仁四周，著色較深的為異染色質(zhì)，其余著色較淺的是常染色質(zhì)。