【正文】 品、金屬器械18磅20分鐘。(1)空氣：空氣是微生物傳播的最主要途徑。(4)血清：有些血清在生產(chǎn)時就已被支原體或病毒等污染，即可成為污染的來源。（2）胰蛋白酶、EDTA:胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要徹底清洗，否則細胞易脫壁。5傳代（passage）也稱再培養(yǎng)無論是否稀釋，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉移或移植到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。（3）減少細胞之間交叉污染的危險性。預防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于用量5~10倍的沖洗法。 (3)首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些．使細胞能盡快適應新環(huán)境而利于細胞生存和增殖。 采用酶消化法傳代。為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細胞體外培養(yǎng)與原組織的差異性．原代取材時要同時留好組織學標本和電鏡標本，并詳細記錄。(3）放置2—4h待組織小塊貼附后．將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉平放、靜止培養(yǎng)。29．判斷細胞健康的標準是什么？1形態(tài)學2細胞染色體分析3同工酶檢查4DNA指紋技術檢測5抗原標記6細胞生長實驗30. 培養(yǎng)過程中支原體和病毒污染的特點是什么？支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結構。在短時間內(nèi)檢測分析大量細胞, 并收集、儲存和處理數(shù)據(jù), 進行多參數(shù)定量分析。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。 ，在流式細胞儀的激光束照射下，會產(chǎn)生哪三大信號？這三大信號分別代表什么？1前向角散射，即FSC，與細胞直徑成正相關，所以我們平時上機的時候，有時用FSC做閾值，排除碎片及其它顆粒，避免干擾。在這種約束作用下，細胞排成單列一個跟隨一個地在鞘液包裹下由流動室下面的噴嘴中心噴出，形成細胞液柱。在檢測之前，儀器已經(jīng)CaliBRITE beads和HLAB27 calibration beads調(diào)試成功，并通過試劑批號的后綴確定了decision marker的位置?？朔@種誤差的最有效方法是使用熒光補償電路，利用標準已知樣品或熒光小珠，可合理設置熒光信號的補償值。44. 簡述TUNEL法檢測細胞凋亡的實驗原理細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50300kb的大片段。因此 ,通過流式細胞術PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時 ,可以將細胞周期各時相區(qū)分為G1 /G0期 ,S期和G2 /M期 ,并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。細胞凋亡作為生理性主動性的過程，能確保正常生長，發(fā)育，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，發(fā)揮積極的防御功能。 6)電源應裝置穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)會降低汞燈的使用壽命并影響鏡檢效果。因此。范圍 細胞凋亡是單個散在的細胞；細胞壞死是大片組織或成群細胞。調(diào)節(jié)過程 細胞凋亡受基因控制；細胞壞死被動進行。細胞體積 細胞凋亡時固縮變小；細胞壞死時腫脹變大。TUNEL法。放大率就是放大倍數(shù)，是指被檢物體經(jīng)物鏡、目鏡放大后，人眼所看到的最終圖象的大小與原物體大小的比值，是物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積，如目鏡為 10倍，物鏡為40倍，則放大倍數(shù)為 40 X 10倍（放大400倍）。香柏油可產(chǎn)生青色熒光。 4顯微結構:，細胞膜保持完整一直到形成凋亡小體, 染色質(zhì)聚集、分塊、位于核膜上呈半月狀，細胞器無明顯變化,細胞體積固縮變小,凋亡小體形成4凋亡小體4細胞壞死:胞質(zhì)內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、崩解，結構脂滴游離、空泡化，蛋白質(zhì)顆粒增多，核發(fā)生固縮或斷裂在蘇木精/伊紅染色,胞質(zhì)呈均一的深伊紅色，原有的微細結構消失。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。將AnnexinV進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的AnnexinV作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。FCM數(shù)據(jù)顯示通常有一維直方圖、二維點圖、二維密度圖、二維等高圖、假三維圖等。3熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。原代培養(yǎng)3—5d需換液一次．去除漂浮的組織塊和殘留的血細胞，因為已漂浮的組織塊及很多細胞碎片含有有毒物質(zhì)，影響原代細胞的生長，要及時清除。如果用膠原酶或EDTA應先用緩沖液洗。防止細胞機械損傷：取材和原代細胞制作時．耍用鋒利的器械，避免組織干燥：要仔細去除所取材料上的血液(血塊)、脂肪、壞死組織及結締組織，切碎組織時應避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進行。少數(shù)細胞系在此期可能發(fā)生自發(fā)或誘發(fā)轉化，獲得不死性而成為無限細胞系，此時細胞核型多變成異倍體。(2)原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長，上皮樣細胞和成纖維樣細胞并存的情況很多見．傳代時不同的細胞有不同的消化時間，因而要注意觀察及時進行處理。降低人力和物力。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。膠原酶的常用劑量為 200 U／ml（約為 lmg／ml）或 0．03％－0．3％。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，溶解及作用的最佳PH是8－9，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制，％ 。因此工作時減少空氣流動是防止污染的重要環(huán)節(jié)。最常見的是75%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。1. 紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養(yǎng)器 。，使用過的玻璃和塑料制品應如何處理后重復使用？1. 常用玻璃器皿清洗：浸泡（自來水）刷洗（洗潔精）酸泡5％鹽酸過夜（不少于6小時）流水沖洗蒸溜水浸泡和沖洗（注滿水－倒空）50℃烘干121℃高壓蒸汽滅菌20min2. 塑料制品的清洗： 料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的成品，打開包裝即可用,多為一次性物品。 （4） 無毒11. 選擇血清需注意事項有哪些？注意事項：①血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關鍵。9舉例說明細胞生長曲線的制作方法？⑴計算細胞濃度2次，得出細胞