現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究方法學(xué)生(存儲版)
【正文】 酸化；隨后，在 SUMO的碳端和 E1的絲氨酸殘基形成一個硫脂的結(jié)合，并釋放出 AMP。 但是當(dāng) IκB被 SUMO修飾后卻能免受 TNF誘導(dǎo)的降解 ， 使 NFκB－ IκB－ SUMO復(fù)合體繼續(xù)穩(wěn)定的存在于胞漿中 ， 進(jìn)而抑制 NFκB的轉(zhuǎn)錄活性 。 4，增加蛋白質(zhì)分子表面的負(fù)電荷。 質(zhì)譜分析蛋白磷酸化 乙?；惓Ｅc疾病 ? CBP/p300的突變導(dǎo)致 Rubinstein Taybi綜合征，患者智力低下、面部畸形、姆指和拇趾粗大、身材矮小。 ? 而帶正電荷的賴氨酸殘基與 DNA之間的相互作用可限制核小體在 DNA之間的移動，使啟動子接近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，組蛋白低乙?；谷旧|(zhì)失去轉(zhuǎn)錄活性。 蛋白核漿轉(zhuǎn)運(yùn)模型： 含有典型的 NLS序列的蛋白被 importin?識別，再與 importin?結(jié) 合形成三聚體，并通過 importin?靶向核孔完成蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程。 而 P34cdc2對 NLS磷酸化則抑制蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn)。 ◆ 蛋白激酶磷酸化位點(diǎn) ：如 SRF蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子 ， 其入核需要 PKA活性 ， 但不是直接被 PKA磷酸化 ， 說明蛋白激酶除了對轉(zhuǎn)錄因子直接磷酸化外 ， 還可能對蛋白入核轉(zhuǎn)運(yùn)下游的其它蛋白磷酸化 ， 從而間接影響轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)運(yùn) 。 NTF2與 RanGTP無親合力，所以可以釋放在細(xì)胞核中。 效應(yīng)蛋白： Ran GTPase激活蛋白： RanGAP (細(xì)胞質(zhì) ) RanGAP結(jié)合蛋白： RanBP1 和 RanBP2 (細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞核 ) 鳥嘌呤核苷交換因子： RanGEF（ 也稱 RCC1） 細(xì)胞核中 RanGTP再生 核轉(zhuǎn)運(yùn)因子 2(NTF2)與 RanGDP復(fù)合體到達(dá)細(xì)胞核時遇到 RanGEF（ 鳥嘌呤核苷交換因子 ） ， 它便將 Ran上的 GDP替換成 GTP。 ? 蛋白乙?；淖饔檬蔷S持染色質(zhì)的開放結(jié)構(gòu)，因而有利于轉(zhuǎn)錄因子與靶 DNA結(jié)合，進(jìn)而促使基因的轉(zhuǎn)錄。 磷酸化研究方法 ? 特異性磷酸化抗體直接證明 ? CIAP或 OA間接證明 ? 片段缺失突變和點(diǎn)突變直接證明 ? 同位素標(biāo)記 ? 質(zhì)譜分析 CIAP或 OA處理細(xì)胞證明蛋白磷酸化 CIAP：牛小腸堿性磷酸酶，能夠?qū)?DNA以及蛋白上的磷酸根基團(tuán)去除（孵育蛋白）； OA：岡田酸，磷酸酶抑制劑（細(xì)胞處理） 片段缺失突變確定磷酸化的初步位點(diǎn) 點(diǎn)突變確定磷酸化的精確位點(diǎn) (For Erk/MAPK) AKT: RXRXXS TR3: RDHLAS Motif 原理：將未被磷酸化的蛋白與被磷酸化后的蛋白用蛋白酶水解后，進(jìn)行 MS/MS分析，到數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。 2，磷酸化改變了轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象 。 IκB經(jīng)腫瘤壞死因子 TNF的刺激 ， 在 S32和 S36發(fā)生磷酸化 ， 進(jìn)而被泛素化 。 形成異肽鍵所需的甘氨酸殘基在泛素和 SUMO1中是保守的 。 α亞基主要用于底物識別， β亞基主要參與底物降解。 泛素的二級結(jié)構(gòu)包括了 5個 β折疊， 35個 α螺旋及 7個反螺旋，其外觀是一個緊密壓縮的球狀蛋白質(zhì)，從球體的表面伸出 4個 C末端殘基，作為泛素化蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn) . 泛素肽鏈中約 70%由氫鍵組成，決定了它的熱穩(wěn)定特性及耐受寬范圍的pH值。蛋白質(zhì)的功能與其空間定位有著密切的相關(guān)，且 通過在不同亞細(xì)胞環(huán)境里的轉(zhuǎn)位而發(fā)揮作用。 透射電子顯微 鏡 TEM優(yōu)點(diǎn)： 1，極高的分辨率和放大倍數(shù) 。 核磁共振儀分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 核磁共振圖譜 計(jì)算方程： lg(Fo/F1)=lgKA+nlg[Q]； 其中： Fo， F分別為蛋白質(zhì)與藥物作用前后的熒光強(qiáng)度； [Q]為藥物濃度； KA為結(jié)合常數(shù)。 ? 它在線粒體上以單體和聚合體兩種不同的物理形式存在。 ? 最常用的兩種細(xì)胞融合： NIH3T3, HeLa ? 研究過程需要用 CHX， 以抑制新的蛋白合成 小鼠成纖維細(xì)胞 :NIH3T3 人宮頸癌細(xì)胞 :HeLa 相差顯微鏡技術(shù) ? 相差顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡最主要的不同點(diǎn)是在物鏡后面安裝一塊“相差板”，偏轉(zhuǎn)的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對樣品不同密度造成的相位差起了放大的作用。 ? 優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，可以實(shí)時跟蹤觀察 光漂白后熒光恢復(fù) (FRAP) ? 光漂白后熒光恢復(fù) : 就是在光漂白后對樣本確定區(qū)中的熒光恢復(fù)。通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA相互作用的信息。它是一種比反義技術(shù)更為有效的方法，具有更高的特異性。現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué) 研究方法 吳 喬 Add：生物館 II 322 Tel： 2187959 基因研究的各種方法 Northern blotting 關(guān)鍵點(diǎn)： DNA探針， 標(biāo)記試劑盒（同位素和 非同位素）；設(shè)內(nèi)標(biāo)； 優(yōu)點(diǎn)：特異性和敏感性高 缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)繁瑣，同位素 基因水平的檢測 同位素標(biāo)記細(xì)胞中的受體基因表達(dá)水平 RTPCR ? RTPCR主要由兩大步驟組成，一是反轉(zhuǎn)錄（ RT），二是 PCR。它由雙鏈 RNA產(chǎn)生，可以特異性地降解具有相同或者相似序列的 RNA（包括 mRNA）。 ? ?實(shí)驗(yàn)過程： DNA片段 (probe)進(jìn)行末端標(biāo)記（同位素、生物素或熒光） ?probe與核蛋白孵育 電泳 干膠 曝光 染色質(zhì)免疫共沉淀 （ ChIP） ? 利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的 DNA片段沉淀下來。 ? 關(guān)鍵點(diǎn)：相應(yīng)的抗體； ? 熒光染料； 熒光顯微鏡 激光共聚焦顯微鏡技術(shù) ? 采用激光做光源 ,激光束經(jīng)照明針孔 ,由分光鏡反射至物鏡并聚焦于樣品上 ,對標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描 ,然后 ,激發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡 ,通過探測針孔時先聚焦 ,聚焦后的光被光電倍增管探測收集 ,并將信號輸送到計(jì)算機(jī) ,在顯示屏上顯示圖像。 目前比較有效的融合劑是高 pH，高 Ca， 和聚乙二醇 PEG。 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中 DNA合成量 (BrdU法 ) ? JC－ 1是一種碳氰化合物類陽離子熒光染料，具有電勢依賴性積聚于線粒體內(nèi)膜的特性。 ? 用于測定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu) 相對 變化和變化速度的方法有： 熒光滴定技術(shù) ，紫外差吸收， 園二色光譜 ，紅外光譜 ， Raman光譜 ，脲梯度電泳，各種反應(yīng)基團(tuán)的暴露。 而相對于晶體學(xué)方法來說 ， AFM分析不需要依靠于晶體樣品 ， 這非常有利于研究天然狀態(tài)下的生物樣品 。 不足： 1，分辨率較低（ 30－ 60埃） 2，觀察 “ 死 ” 樣品
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1