【正文】 和蛋白質(zhì)構(gòu)成的大小亞基組成的橢圓形顆粒，附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的稱附著核糖體，此外還有散在于細胞質(zhì)中的游離核糖體，而多個核糖體由mRNA串連在一起叫多聚核糖體。核中央海綿狀的一團深色結(jié)構(gòu)是核仁。 二、器材和儀器 光鏡、2ml注射器、載玻片、蓋玻片、解剖器材、滴管、移液管、試管、玻璃片、黑紙。吞噬細胞首先由于趨化作用而向異物游走，然后伸出偽足包圍異物，并發(fā)生內(nèi)吞作用形成吞噬泡將異物吞入細胞，繼而溶酶體與吞噬泡融合消化異物。利用此照明法，在鏡檢時不能直接看到通過標本的照明光線，只有被檢物體反射或衍射的光線進入物鏡可以提高分辨率，在暗視野中可以看到明亮的被檢物體的存在和運動，但它們的內(nèi)部結(jié)構(gòu)卻看不清楚。圖6—1中央遮光板a．光圈孔徑 b．濾光片直徑 (三)觀察蟾蜍上頜粘膜上皮細胞的纖毛運動 步驟： 1．用搗毀腦脊髓的方法處死蟾蜍。 (四)暗視野觀察蟾蜍精子的鞭毛運動 步驟： l．將前面實驗所用蟾蜍沿腹中線開腹，暴露出黃色圓柱狀精巢。 其體表，均勻密布纖毛，為運動細胞器。 2．觀察草履蟲的運動方式(觀察時光線可調(diào)暗些)：可見鏡下有許多樣似倒置鞋底的草履蟲，體表纖毛不斷擺動，蟲體以其中軸左旋前進，若遇阻力則試觸后即刻回避而轉(zhuǎn)向。它是利用化學試劑與細胞內(nèi)的某些物質(zhì)進行化學反應，從而在細胞局部形成有色沉淀物，再通過顯微鏡對組織內(nèi)的生物化學成分進行定性、定位、定量研究。放入純丙酮中分色2～3秒鐘。（二）方法1．以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤中，剪開胸腔，打開心包。（三）結(jié)果經(jīng)堿性固綠染色片中，胞質(zhì)、核仁不著色，細胞核大部分被染成綠色，是為堿性蛋白質(zhì)存在處（參照照片）。6．清水沖洗，室溫晾干。 4．脫蠟：二甲苯(1)5分鐘→二甲苯(2)5分鐘→100％乙醇5分鐘→含1％火棉膠的乙醇液1分鐘→70％乙醇1分鐘。 12．加蓋片鏡檢或樹膠封固后鏡檢。 分離細胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進行分離，其過程包括組織細胞勻漿、分級分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細胞成分的化學組成、理化特性及其功能的主要手段。 3．剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動研磨3～5次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標記，自然干燥。 (二)結(jié)果 油鏡下觀察，顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染成藍綠色。 一、動物細胞無絲分裂的觀察一蛙血涂片 (一)原理 無絲分裂不僅是原核生物增殖的方式，而且雷馬克(Remak)于1841年最早在雞胚血細胞中也發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，因為此過程沒有出現(xiàn)紡錘絲和染色體的變化，故稱無絲分裂(Ami— tosis)。每個卵細胞都包在卵殼之中，卵殼與卵細胞之間的腔，叫卵殼腔。 末期(Telophase)移向兩極的染色體恢復染色質(zhì)狀態(tài)，核膜、核仁重新出現(xiàn)，最后細胞膜橫縊，兩個子細胞形成。 2．取材 將采到的雄蟲，用大頭針固定在木板或紙盒上，沿腹部背中線剪開體壁，見消化管背側(cè)的淺黃色結(jié)構(gòu)即是精巢，用鑷子分離出來。 (1)前期I(Prophase I)在減數(shù)分裂中，以前期I最有特征性、核的變化復雜，依染色體變化，又可分為下列各期：細線期(Leptotene stage)染色體呈細長的絲，稱為染色線。(3)后期I(Anaphase I)由于紡錘絲的解聚變短，同源的兩條染色體彼此分開，分別向兩極移動。 (4)末期Ⅱ(TelophaseⅡ)移到兩極的染色體分別組成新核，新細胞的核具單倍數(shù)(n)的染色體組，胞質(zhì)再次分裂，這樣，通過減數(shù)分裂每個初級精母細胞就形成了四個精細胞。 二、器材和儀器 超凈臺、煤氣燈、乳膠管、火柴、鑷子、廢液缸、離心機、水浴箱、定時鐘、天平、離心管(10m1)、乳頭吸管、顯微鏡、載玻片、平皿等。各種因素的效應(如病毒、電離輻射、化學藥劑等)也可在淋巴細胞的培養(yǎng)條件下進行觀察，從而進行多種在體內(nèi)無法進行的研究。每個培養(yǎng)瓶接種全血O．2ml左右輕輕搖動使血和培養(yǎng)液混勻。 2．按時終止培養(yǎng)，用吸管溫和吹打成細胞懸液后，移至10ml離心管中。 5．吸取1～2滴懸液，在距載片約15cm高度滴于預冷的干凈載玻片上，迅速對準細胞吹氣促進染色體分散。 2．數(shù)目異常 由于腫瘤細胞分裂失去應有的調(diào)控，可出現(xiàn)亞二倍體、超二倍體和多一倍體數(shù)目異?，F(xiàn)象。 (三)結(jié)果 計數(shù)HeLa細胞和HL—60細胞的染色體數(shù)并尋找是否有畸變的染色體。七組染色體的基本形態(tài)特征及分析順序是： A組是七組染色體中最大的一組，首先找出它。 余者為C組：C組七對即第6～12號14條染色體，按大小順序依次排列，均是亞中著絲點；X染色體被隸屬該組，大小居6～7號之間，是亞中著絲點。 細胞融合的誘導物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。待PEG全部加入后靜置1分鐘左右。2．你測定的細胞融合率為多少?(張之曾編)實驗十二 應用細胞融合技術(shù)制備染色體提前凝集標本【實驗目的】 通過細胞融合技術(shù)，初步了解染色體提前凝集標本制備原理、方法及間期細胞三種時相的提前凝集染色體特點。 二、方法 1．收集培養(yǎng)的M期HeLa細胞 取一瓶處于對數(shù)生長期的HeLa細胞，向培養(yǎng)基中加入10μg／／ml，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12小時，使大量生長的細胞被阻斷于M期。 (1)將上述l、2兩管細胞倒入一個離心管中充分混勻。在37℃處理25分鐘左右；終止時加入lml Carnoy固定液進行固定，1000rpm離心8分鐘，去掉上清，指彈離心管底部使細胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30分鐘，1000rpm離心5分鐘，用吸管輕輕吹打成懸液，取預冷的載玻片滴一張片，烤干后，Giemsa染色15分鐘左右，水沖洗，干燥后鏡檢。棄去上清，加入2ml有血清的RPMI一1640培養(yǎng)基，同時用針頭的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，輕輕吹打成懸液，37℃水浴中溫育30~60分鐘。用吸管吹打成單個懸浮細胞備用。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。 四、融合率的計算 在高倍鏡下隨機計數(shù)200個細胞(包括融合的與未融合的細胞)，以融合細胞(含兩個或兩個以上的細胞核的細胞)的細胞核數(shù)除以總細胞核數(shù)(包括融合與未融合的細胞核)即得出融合率。 (3)取上述10％的雞紅細胞懸液1ml放入離心管中，再加入5ml Hanks液混勻，然后以1,000rpm離心5分鐘，小心棄去上清，用指彈法將細胞團塊彈散。人工誘導的細胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。 第四確定F組：F組二對即第19～20號4條染色體，染色體比G組稍大、均為中央著絲點。通過常規(guī)核型的分析必須掌握三點：(一)會分組、(二)了解各組染色體的基本形態(tài)特征、(三)會計數(shù)數(shù)目和鑒定性別。加入少許低滲液將細胞從瓶壁洗脫，移入10ml離心管，加入預熱37℃的低滲液至5 ~ 6ml，在37℃處理25分鐘。 三、腫瘤細胞的染色體標本制備 (一)原理 利用腫瘤細胞無限繁殖的特點，掌握其體外生長動態(tài)，取處于對數(shù)生長期的細胞便可獲得豐富的分裂相。然后離心，棄上清，重復固定一次。再結(jié)合離心技術(shù)去掉紅細胞碎片，然后采用空氣干燥法制片獲得中期染色體標本。 2． PHA溶液，封好備用。 人體微量全血培養(yǎng)是一種簡單的淋巴細胞培養(yǎng)方法。了解正常及腫瘤細胞核型的一般特征。 (2)中期Ⅱ(MetaphaseⅡ)紡錘體再次出現(xiàn)，染色體排列于赤道面。(2)中期I(Metaphase I)核膜和核仁消失，紡錘體形成，雙價染色體排列于赤道面，著絲點與紡錘絲相連。 1．精原細胞(Spermatogonia) 位于精細管的游離端，胞體較小，由有絲分裂來增殖，其染色體較粗短、染色較濃。 (二)蝗蟲精巢壓片標本的制備 l．采集 采集到各期分裂相的標本是實驗成功的關(guān)鍵，解決這一關(guān)鍵要把握兩點(1)時間：沈陽地區(qū)采集，一般在8月15至25日為宜；(2)蟲體特征：雄蟲翹膀長到剛好蓋住腹部一半時，正好是雄蟲精子發(fā)生的峰季，采集最適。 中期(Metaphase)染色體聚集排列在細胞的中央形成赤道板，由于細胞切面不同，此期有側(cè)面觀和極面觀的兩種不同現(xiàn)象，側(cè)面觀染色體排列在細胞中央，兩極各有一個中心體，中心體之間的紡錘絲與染色體著絲點相連；極面觀由于染色體平排于赤道面上，六條染色體清晰可數(shù)，此時的染色體已縱裂為二，但尚未分離。 馬蛔蟲受精卵細胞中只有6條染色體，而洋蔥體細胞的染色體為16條，因為它們都具有染色體數(shù)目少的特點，所以便于觀察和分析。 三、試劑 Carnoy固定液、70％乙醇、醋酸洋紅染液、45％醋酸、二甲苯。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物， 0．25mol／／L氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。 二、細胞核的分離提取 (一)操作步驟 1．用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，剪成小塊(去除結(jié)締組織)％NaCl的燒杯中，反復洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。 三、試劑 ／／L氯化鈣溶液、1％甲苯胺蘭染液、％詹納斯綠B染液、％NaCl溶液。 10．浸入Ehrlich蘇木精復染20~30秒，使細胞核著色。石蠟包埋，切片。4．取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應6分鐘。6. ％堿性固綠(～)中染色10～15分鐘,％酸性固綠(～)染色5～10分鐘。如在生理條件下，整個蛋白質(zhì)所帶負電荷多，則為酸性蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。 4．浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中30分鐘染色。 二、器材和儀器 光學顯微鏡、解剖器材、蠟盤、載玻片、吸水紙、染色缸、蓋玻片、水浴箱。 實驗步驟： 1．取一滴草履蟲培養(yǎng)液于載玻片上，放上幾根棉花纖維，以減慢草履蟲的運動。 三、草履蟲纖毛運動及食物泡的形成圖6—3 草履蟲 草履蟲是一種單細胞動物。圖6—2 蟾蜍口腔內(nèi)面圖 結(jié)果： 1．在低倍鏡下觀察上頜粘膜細胞纖毛運動的現(xiàn)象。5．將中央遮光板放置在顯微鏡的濾光框上，即可進行標本的暗視野觀察。 二、暗視野觀察細胞的纖毛和鞭毛運動 (一)原理 暗視野照明法是一種不使照射被檢物體的光線直接進入物鏡的照明方法。單核細胞由血液進入組織后逐漸演變成巨噬細胞。(時偉紅編)實驗六 細胞生理活動的實驗觀察【實驗目的】 通過制片與觀察加深理解細胞的運動、吞噬等生理活動。 三、觀察恒河猴脊髓前角運動細胞的電鏡照片，總結(jié)細胞的超微結(jié)構(gòu) 照片中是一個多角形的脊髓前角運動細胞，細胞表面以非常細的線條與周圍分界，就是細胞膜。 (四)溶酶體(Lysosome) 小鼠肝細胞、人胃癌細胞溶酶體電鏡照片：溶酶體為一層單位膜包圍的囊狀結(jié)構(gòu)。染色體中心體圖5—3馬蛔蟲受精卵細胞、分裂中期(示中心體) 二、六種細胞器的電鏡照片 （一）高爾基復合體(Golgi Complex)人體胃粘膜細胞高爾基復合體電鏡照片：細胞質(zhì)中有散在的高爾基復合體，其結(jié)構(gòu)要由三部分組成：扁平囊、大囊泡和小囊泡，它們共同構(gòu)成緊密重疊的囊泡結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，細胞中央不著色的圓形區(qū)為細胞核。 3．再取一塊麗藻葉片，滴一滴細胞松弛素B，10~15分鐘后蓋上蓋片，觀察。 二、麗藻細胞內(nèi)胞質(zhì)環(huán)流及其對細胞松弛素B的反應 (一)原理 麗藻細胞大，整個細胞的中央為大液泡占據(jù)。②將蓋片移入2％Triton X一100液，置37℃恒溫箱內(nèi)處理20～30分鐘，以提取骨架以外的蛋白質(zhì)，使骨架圖像清晰?！緦嶒瀮?nèi)容】 一、成纖維細胞微絲的染色及其對細胞松馳素B的反應(一)原理微絲普遍存在于多種細胞，對細胞的形狀和運動有一定作用。 (三)結(jié)果 顯微鏡下觀察，可見軟骨細胞為橢圓形，細胞核周圍有許多染成玫瑰紅色．大小不一的小泡，即軟骨細胞液泡系。 (時偉紅編)實驗三 液泡系(Vacuolar system)的活體染色及電鏡照片觀察【實驗目的】掌握一種活體染色方法，了解光學顯微鏡和電子顯微鏡下液泡系的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。一般與線粒體長軸垂直排列，但也可見到與線粒體長軸平行排列的脊。 染色后，將組織塊移到載片上，用鑷子將組織塊拉碎，就會有一些細胞或細胞群從組織塊脫離。 三、試劑 l／300詹納斯綠B染液、Ringer氏液(哺乳類用)。鏡臺測微尺是在一個載片中央封固的尺，長1毫米(1000μm)，被分為100格，每格長度是10微米。顯微鏡觀察可見人紅細胞為凹圓盤形，無核。顯微鏡下觀察可見肝細胞核染成蘭色，肝細胞緊密排列，擠成多角形(參照照片)。在顯微鏡下觀察，染色較深的小細胞是神經(jīng)膠質(zhì)細胞。 不論細胞的形狀如何，細胞的結(jié)構(gòu)一般分為三大部分：細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核。各引線要平行不得交叉。持法如圖。針頭刺入腹腔后切勿左右擺動，以免損傷腸管或肝臟。 2．處死方法：