【正文】 和蛋白質(zhì)構(gòu)成的大小亞基組成的橢圓形顆粒，附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的稱附著核糖體，此外還有散在于細(xì)胞質(zhì)中的游離核糖體，而多個(gè)核糖體由mRNA串連在一起叫多聚核糖體。核中央海綿狀的一團(tuán)深色結(jié)構(gòu)是核仁。 二、器材和儀器 光鏡、2ml注射器、載玻片、蓋玻片、解剖器材、滴管、移液管、試管、玻璃片、黑紙。吞噬細(xì)胞首先由于趨化作用而向異物游走，然后伸出偽足包圍異物，并發(fā)生內(nèi)吞作用形成吞噬泡將異物吞入細(xì)胞，繼而溶酶體與吞噬泡融合消化異物。利用此照明法，在鏡檢時(shí)不能直接看到通過標(biāo)本的照明光線，只有被檢物體反射或衍射的光線進(jìn)入物鏡可以提高分辨率，在暗視野中可以看到明亮的被檢物體的存在和運(yùn)動(dòng)，但它們的內(nèi)部結(jié)構(gòu)卻看不清楚。圖6—1中央遮光板a．光圈孔徑 b．濾光片直徑 (三)觀察蟾蜍上頜粘膜上皮細(xì)胞的纖毛運(yùn)動(dòng) 步驟： 1．用搗毀腦脊髓的方法處死蟾蜍。 (四)暗視野觀察蟾蜍精子的鞭毛運(yùn)動(dòng) 步驟： l．將前面實(shí)驗(yàn)所用蟾蜍沿腹中線開腹，暴露出黃色圓柱狀精巢。 其體表，均勻密布纖毛，為運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器。 2．觀察草履蟲的運(yùn)動(dòng)方式(觀察時(shí)光線可調(diào)暗些)：可見鏡下有許多樣似倒置鞋底的草履蟲，體表纖毛不斷擺動(dòng)，蟲體以其中軸左旋前進(jìn)，若遇阻力則試觸后即刻回避而轉(zhuǎn)向。它是利用化學(xué)試劑與細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而在細(xì)胞局部形成有色沉淀物，再通過顯微鏡對(duì)組織內(nèi)的生物化學(xué)成分進(jìn)行定性、定位、定量研究。放入純丙酮中分色2～3秒鐘。（二）方法1．以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤中，剪開胸腔，打開心包。（三）結(jié)果經(jīng)堿性固綠染色片中，胞質(zhì)、核仁不著色，細(xì)胞核大部分被染成綠色，是為堿性蛋白質(zhì)存在處（參照照片）。6．清水沖洗，室溫晾干。 4．脫蠟：二甲苯(1)5分鐘→二甲苯(2)5分鐘→100％乙醇5分鐘→含1％火棉膠的乙醇液1分鐘→70％乙醇1分鐘。 12．加蓋片鏡檢或樹膠封固后鏡檢。 分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。 3．剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨3～5次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標(biāo)記，自然干燥。 (二)結(jié)果 油鏡下觀察，顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染成藍(lán)綠色。 一、動(dòng)物細(xì)胞無絲分裂的觀察一蛙血涂片 (一)原理 無絲分裂不僅是原核生物增殖的方式，而且雷馬克(Remak)于1841年最早在雞胚血細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，因?yàn)榇诉^程沒有出現(xiàn)紡錘絲和染色體的變化，故稱無絲分裂(Ami— tosis)。每個(gè)卵細(xì)胞都包在卵殼之中，卵殼與卵細(xì)胞之間的腔，叫卵殼腔。 末期(Telophase)移向兩極的染色體恢復(fù)染色質(zhì)狀態(tài)，核膜、核仁重新出現(xiàn)，最后細(xì)胞膜橫縊，兩個(gè)子細(xì)胞形成。 2．取材 將采到的雄蟲，用大頭針固定在木板或紙盒上，沿腹部背中線剪開體壁，見消化管背側(cè)的淺黃色結(jié)構(gòu)即是精巢，用鑷子分離出來。 (1)前期I(Prophase I)在減數(shù)分裂中，以前期I最有特征性、核的變化復(fù)雜，依染色體變化，又可分為下列各期：細(xì)線期(Leptotene stage)染色體呈細(xì)長的絲，稱為染色線。(3)后期I(Anaphase I)由于紡錘絲的解聚變短，同源的兩條染色體彼此分開，分別向兩極移動(dòng)。 (4)末期Ⅱ(TelophaseⅡ)移到兩極的染色體分別組成新核，新細(xì)胞的核具單倍數(shù)(n)的染色體組，胞質(zhì)再次分裂，這樣，通過減數(shù)分裂每個(gè)初級(jí)精母細(xì)胞就形成了四個(gè)精細(xì)胞。 二、器材和儀器 超凈臺(tái)、煤氣燈、乳膠管、火柴、鑷子、廢液缸、離心機(jī)、水浴箱、定時(shí)鐘、天平、離心管(10m1)、乳頭吸管、顯微鏡、載玻片、平皿等。各種因素的效應(yīng)(如病毒、電離輻射、化學(xué)藥劑等)也可在淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行觀察，從而進(jìn)行多種在體內(nèi)無法進(jìn)行的研究。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種全血O．2ml左右輕輕搖動(dòng)使血和培養(yǎng)液混勻。 2．按時(shí)終止培養(yǎng)，用吸管溫和吹打成細(xì)胞懸液后，移至10ml離心管中。 5．吸取1～2滴懸液，在距載片約15cm高度滴于預(yù)冷的干凈載玻片上，迅速對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞吹氣促進(jìn)染色體分散。 2．?dāng)?shù)目異常 由于腫瘤細(xì)胞分裂失去應(yīng)有的調(diào)控，可出現(xiàn)亞二倍體、超二倍體和多一倍體數(shù)目異常現(xiàn)象。 (三)結(jié)果 計(jì)數(shù)HeLa細(xì)胞和HL—60細(xì)胞的染色體數(shù)并尋找是否有畸變的染色體。七組染色體的基本形態(tài)特征及分析順序是： A組是七組染色體中最大的一組，首先找出它。 余者為C組：C組七對(duì)即第6～12號(hào)14條染色體，按大小順序依次排列，均是亞中著絲點(diǎn)；X染色體被隸屬該組，大小居6～7號(hào)之間，是亞中著絲點(diǎn)。 細(xì)胞融合的誘導(dǎo)物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺(tái)病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。待PEG全部加入后靜置1分鐘左右。2．你測定的細(xì)胞融合率為多少?(張之曾編)實(shí)驗(yàn)十二 應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)制備染色體提前凝集標(biāo)本【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 通過細(xì)胞融合技術(shù)，初步了解染色體提前凝集標(biāo)本制備原理、方法及間期細(xì)胞三種時(shí)相的提前凝集染色體特點(diǎn)。 二、方法 1．收集培養(yǎng)的M期HeLa細(xì)胞 取一瓶處于對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入10μg／／ml，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，使大量生長的細(xì)胞被阻斷于M期。 (1)將上述l、2兩管細(xì)胞倒入一個(gè)離心管中充分混勻。在37℃處理25分鐘左右；終止時(shí)加入lml Carnoy固定液進(jìn)行固定，1000rpm離心8分鐘，去掉上清，指彈離心管底部使細(xì)胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30分鐘，1000rpm離心5分鐘，用吸管輕輕吹打成懸液，取預(yù)冷的載玻片滴一張片，烤干后，Giemsa染色15分鐘左右，水沖洗，干燥后鏡檢。棄去上清，加入2ml有血清的RPMI一1640培養(yǎng)基，同時(shí)用針頭的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，輕輕吹打成懸液，37℃水浴中溫育30~60分鐘。用吸管吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞備用。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。 四、融合率的計(jì)算 在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，以融合細(xì)胞(含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。 (3)取上述10％的雞紅細(xì)胞懸液1ml放入離心管中，再加入5ml Hanks液混勻，然后以1,000rpm離心5分鐘，小心棄去上清，用指彈法將細(xì)胞團(tuán)塊彈散。人工誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。 第四確定F組：F組二對(duì)即第19～20號(hào)4條染色體，染色體比G組稍大、均為中央著絲點(diǎn)。通過常規(guī)核型的分析必須掌握三點(diǎn)：(一)會(huì)分組、(二)了解各組染色體的基本形態(tài)特征、(三)會(huì)計(jì)數(shù)數(shù)目和鑒定性別。加入少許低滲液將細(xì)胞從瓶壁洗脫，移入10ml離心管，加入預(yù)熱37℃的低滲液至5 ~ 6ml，在37℃處理25分鐘。 三、腫瘤細(xì)胞的染色體標(biāo)本制備 (一)原理 利用腫瘤細(xì)胞無限繁殖的特點(diǎn)，掌握其體外生長動(dòng)態(tài)，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞便可獲得豐富的分裂相。然后離心，棄上清，重復(fù)固定一次。再結(jié)合離心技術(shù)去掉紅細(xì)胞碎片，然后采用空氣干燥法制片獲得中期染色體標(biāo)本。 2． PHA溶液，封好備用。 人體微量全血培養(yǎng)是一種簡單的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法。了解正常及腫瘤細(xì)胞核型的一般特征。 (2)中期Ⅱ(MetaphaseⅡ)紡錘體再次出現(xiàn)，染色體排列于赤道面。(2)中期I(Metaphase I)核膜和核仁消失，紡錘體形成，雙價(jià)染色體排列于赤道面，著絲點(diǎn)與紡錘絲相連。 1．精原細(xì)胞(Spermatogonia) 位于精細(xì)管的游離端，胞體較小，由有絲分裂來增殖，其染色體較粗短、染色較濃。 (二)蝗蟲精巢壓片標(biāo)本的制備 l．采集 采集到各期分裂相的標(biāo)本是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，解決這一關(guān)鍵要把握兩點(diǎn)(1)時(shí)間：沈陽地區(qū)采集，一般在8月15至25日為宜；(2)蟲體特征：雄蟲翹膀長到剛好蓋住腹部一半時(shí)，正好是雄蟲精子發(fā)生的峰季，采集最適。 中期(Metaphase)染色體聚集排列在細(xì)胞的中央形成赤道板，由于細(xì)胞切面不同，此期有側(cè)面觀和極面觀的兩種不同現(xiàn)象，側(cè)面觀染色體排列在細(xì)胞中央，兩極各有一個(gè)中心體，中心體之間的紡錘絲與染色體著絲點(diǎn)相連；極面觀由于染色體平排于赤道面上，六條染色體清晰可數(shù)，此時(shí)的染色體已縱裂為二，但尚未分離。 馬蛔蟲受精卵細(xì)胞中只有6條染色體，而洋蔥體細(xì)胞的染色體為16條，因?yàn)樗鼈兌季哂腥旧w數(shù)目少的特點(diǎn)，所以便于觀察和分析。 三、試劑 Carnoy固定液、70％乙醇、醋酸洋紅染液、45％醋酸、二甲苯。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物， 0．25mol／／L氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。 二、細(xì)胞核的分離提取 (一)操作步驟 1．用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，剪成小塊(去除結(jié)締組織)％NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。 三、試劑 ／／L氯化鈣溶液、1％甲苯胺蘭染液、％詹納斯綠B染液、％NaCl溶液。 10．浸入Ehrlich蘇木精復(fù)染20~30秒，使細(xì)胞核著色。石蠟包埋，切片。4．取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng)6分鐘。6. ％堿性固綠(～)中染色10～15分鐘,％酸性固綠(～)染色5～10分鐘。如在生理?xiàng)l件下，整個(gè)蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多，則為酸性蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。 4．浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中30分鐘染色。 二、器材和儀器 光學(xué)顯微鏡、解剖器材、蠟盤、載玻片、吸水紙、染色缸、蓋玻片、水浴箱。 實(shí)驗(yàn)步驟： 1．取一滴草履蟲培養(yǎng)液于載玻片上，放上幾根棉花纖維，以減慢草履蟲的運(yùn)動(dòng)。 三、草履蟲纖毛運(yùn)動(dòng)及食物泡的形成圖6—3 草履蟲 草履蟲是一種單細(xì)胞動(dòng)物。圖6—2 蟾蜍口腔內(nèi)面圖 結(jié)果： 1．在低倍鏡下觀察上頜粘膜細(xì)胞纖毛運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。5．將中央遮光板放置在顯微鏡的濾光框上，即可進(jìn)行標(biāo)本的暗視野觀察。 二、暗視野觀察細(xì)胞的纖毛和鞭毛運(yùn)動(dòng) (一)原理 暗視野照明法是一種不使照射被檢物體的光線直接進(jìn)入物鏡的照明方法。單核細(xì)胞由血液進(jìn)入組織后逐漸演變成巨噬細(xì)胞。(時(shí)偉紅編)實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞生理活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)觀察【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 通過制片與觀察加深理解細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、吞噬等生理活動(dòng)。 三、觀察恒河猴脊髓前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的電鏡照片，總結(jié)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 照片中是一個(gè)多角形的脊髓前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞，細(xì)胞表面以非常細(xì)的線條與周圍分界，就是細(xì)胞膜。 (四)溶酶體(Lysosome) 小鼠肝細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞溶酶體電鏡照片：溶酶體為一層單位膜包圍的囊狀結(jié)構(gòu)。染色體中心體圖5—3馬蛔蟲受精卵細(xì)胞、分裂中期(示中心體) 二、六種細(xì)胞器的電鏡照片 （一）高爾基復(fù)合體(Golgi Complex)人體胃粘膜細(xì)胞高爾基復(fù)合體電鏡照片：細(xì)胞質(zhì)中有散在的高爾基復(fù)合體，其結(jié)構(gòu)要由三部分組成：扁平囊、大囊泡和小囊泡，它們共同構(gòu)成緊密重疊的囊泡結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，細(xì)胞中央不著色的圓形區(qū)為細(xì)胞核。 3．再取一塊麗藻葉片，滴一滴細(xì)胞松弛素B，10~15分鐘后蓋上蓋片，觀察。 二、麗藻細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)環(huán)流及其對(duì)細(xì)胞松弛素B的反應(yīng) (一)原理 麗藻細(xì)胞大，整個(gè)細(xì)胞的中央為大液泡占據(jù)。②將蓋片移入2％Triton X一100液，置37℃恒溫箱內(nèi)處理20～30分鐘，以提取骨架以外的蛋白質(zhì)，使骨架圖像清晰?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】 一、成纖維細(xì)胞微絲的染色及其對(duì)細(xì)胞松馳素B的反應(yīng)(一)原理微絲普遍存在于多種細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的形狀和運(yùn)動(dòng)有一定作用。 (三)結(jié)果 顯微鏡下觀察，可見軟骨細(xì)胞為橢圓形，細(xì)胞核周圍有許多染成玫瑰紅色．大小不一的小泡，即軟骨細(xì)胞液泡系。 (時(shí)偉紅編)實(shí)驗(yàn)三 液泡系(Vacuolar system)的活體染色及電鏡照片觀察【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆找环N活體染色方法，了解光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下液泡系的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。一般與線粒體長軸垂直排列，但也可見到與線粒體長軸平行排列的脊。 染色后，將組織塊移到載片上，用鑷子將組織塊拉碎，就會(huì)有一些細(xì)胞或細(xì)胞群從組織塊脫離。 三、試劑 l／300詹納斯綠B染液、Ringer氏液(哺乳類用)。鏡臺(tái)測微尺是在一個(gè)載片中央封固的尺，長1毫米(1000μm)，被分為100格，每格長度是10微米。顯微鏡觀察可見人紅細(xì)胞為凹圓盤形，無核。顯微鏡下觀察可見肝細(xì)胞核染成蘭色，肝細(xì)胞緊密排列，擠成多角形(參照照片)。在顯微鏡下觀察，染色較深的小細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 不論細(xì)胞的形狀如何，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)一般分為三大部分：細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。各引線要平行不得交叉。持法如圖。針頭刺入腹腔后切勿左右擺動(dòng)，以免損傷腸管或肝臟。 2．處死方法：