細(xì)胞生物學(xué)實驗ppt課件-wenkub
2023-05-23 01:19:10 本頁面
【正文】 ? （ 3）干熱滅菌 ? 主要用于玻璃器皿的滅菌。 （四）消毒和滅菌 ? （ 1）射線消毒滅菌 ? 主要使用 X、 60Co進行消毒滅菌，用于牛血清或塑料制品。 （三）洗液的配制 ? 常用的洗液是硫酸 重鉻酸鉀溶液。 ? （ 1）立即進入清水，避免干涸難洗； （ 2）用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥； （ 3）浸酸性洗液過夜； （ 4）從洗液撈出自來水沖洗 10~15次去除酸性洗液，蒸餾水刷洗 3次，倒置烘干； （ 5）包裝（牛皮紙或不透水紙）； （ 6）高壓（ 15磅 20min)或干熱（ 160度 2h)滅菌； （ 7）備用。假如選用的方法不對，即使達(dá)到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價值、生物學(xué)特性或其他使用價值也不行。 二、實驗原理 ? 清洗與消毒是組織培養(yǎng)實驗的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。 三、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基本概念 （一）動物細(xì)胞培養(yǎng) ? 另一種分類方式將細(xì)胞培養(yǎng)方式大致可分為兩種： ? 一種是群體培養(yǎng)（ mass culture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合（ confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層（貼壁培養(yǎng)）； ? 另一種是克隆培養(yǎng)（ clonal culture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落，稱為克?。?clone）。 2. 傳代培養(yǎng) (subculture):培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是瓶皿或其他容器 ， 生存空間和營養(yǎng)是有限的 ， 當(dāng)細(xì)胞增殖到一定密度后 ， 需要分離出一部分細(xì)胞并更新營養(yǎng)液 ，這一過程稱為傳代 。 最常見的體內(nèi)培養(yǎng)方式就是移植 (transplantation)。 3. 如果試管內(nèi)液體變紅而透明者，稱完全溶血（＋＋＋），鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部呈碎片。 （三）雞紅細(xì)胞的滲透性 液 10ml，再加入 1ml稀釋的雞血，輕輕搖動，注意是否有顏色變化？是否有溶血現(xiàn)象？為什么？ 10ml，再加入 1ml稀釋的雞血，輕輕搖動，注意是否有顏色變化？是否有溶血現(xiàn)象？若發(fā)生溶血，記下時間（自加入 1ml稀釋雞血到溶液變成紅色透明澄清所需時間。 ? 由于溶質(zhì)透入速度不同，溶血時間也不同。 ? 2. 了解各類物質(zhì)進入細(xì)胞的速度。 實驗四 細(xì)胞膜的滲透性 二、實驗原理 ? 細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)，它可選擇性地讓某些物質(zhì)進出細(xì)胞。 溶血 （ hemolysis） : 紅細(xì)胞破裂，血紅蛋白逸出稱紅細(xì)胞溶解，簡稱溶血。 ，步驟同 2。 六、實驗報告 ? 書寫實驗報告，并就細(xì)胞膜對不同物質(zhì)的滲透性不同，對實驗結(jié)果進行分析見表。 (in vitro culture) : 按結(jié)構(gòu)成分分為細(xì)胞培養(yǎng) (cell culture) 組織培養(yǎng) (tissue culture) 器官培養(yǎng) (an culture)。 將細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng) （ Passage） 。一個細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個祖先細(xì)胞。 ? 體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌操作的要求程度很高。 三、實驗內(nèi)容 ? 每一組同學(xué)準(zhǔn)備兩個細(xì)胞培養(yǎng)瓶 ? 每二組配制一份洗液。 （二） Tip和 Tube的清洗 ? （ 1）新的國產(chǎn) Tip和 Tube如用于非 RNA提取時可用蒸餾水刷洗，晾干，高壓滅菌后使用。洗液可根據(jù)需要配制不同的濃度 （ 每 4個同學(xué)配制 120ml強洗液：重鉻酸鉀 、濃硫酸 100ml、蒸餾水 20ml） 成分 強酸洗液 次強酸洗液 重鉻酸鉀 63g 3150g 120g 6000g 濃硫酸 1 000ml 50 000ml 200ml 10 000ml 蒸餾水 200ml 10 000ml 1 000ml 50 000ml 配制方法： ? （ 1）將重鉻酸鉀放入大燒杯中，加入蒸餾水放在石棉網(wǎng)上加熱至沸騰并攪拌，使重鉻酸鉀充分溶解。 ? （ 2）紫外線消毒 ? 一般用無臭氧型紫外燈。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放入干燥箱內(nèi)，加熱至 160度，保溫90~120min。 （七）化學(xué)消毒法 ? （ 1） 70%（ 75%）酒精消毒 ? （ 2） %新潔爾滅消毒 ? （ 3）來蘇兒水消毒 ? （ 4） %過氧乙酸消毒 ? （ 5）乳酸蒸汽消毒 ? （ 6） 37%甲醛加高錳酸鉀消毒 ? （ 7）煮沸消毒 實驗五 宮頸癌 HeLa細(xì)胞株培養(yǎng) 二、培養(yǎng)基的配制 二、實驗原理 ? 組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。小牛血清含有一定的營養(yǎng)成分，更重要的是它含有細(xì)胞生長所必需的生長因子、激素、貼附因子等，是合成培養(yǎng)基所無法替代的。 置于攪拌器上攪拌 40分鐘，直到液體變?yōu)槌吻鍨橹埂? （三）小牛血清的處理 ?新買的新生小牛血清一定要滅活； ?將新生小牛血清不開封置于 56℃ 水浴鍋中 30min,期間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。 ? 20℃ 貯存。 一、實驗?zāi)康? ? 熟練掌握細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作方法。 ? 對于貼壁不太緊的細(xì)胞如 colo320，可以直接吹散后分瓶。這時細(xì)胞由于自身內(nèi)部細(xì)胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力作用下成為球形。 三、儀器、材料和試劑 ? 超凈工作臺 微量加樣器（移液槍） ? 倒置顯微鏡 高壓滅菌鍋 ? 蒸餾水器 超低溫冰箱 ? 二氧化碳培養(yǎng)箱 （一）儀器 （二）用具、材料 ? 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 ? 滴管 ? 培養(yǎng)細(xì)胞 四、實驗步驟 1. RPMI 1640生長培養(yǎng)基的配制 50毫升 儲備液濃 度 終濃度 RPMI 1640培養(yǎng)液 44 — — 谷氨酰胺 30mg/ml 雙抗 100000u/ml 100u/ml 小牛血清 5 — 10% NaHCO3調(diào) pH至 傳代培養(yǎng)步驟（以下均為無菌操作） ? 從培養(yǎng)箱中取出原代培養(yǎng)細(xì)胞并置于超凈工作臺，棄去培養(yǎng)液，加入 %胰酶溶液，以使細(xì)胞貼壁面充分浸潤，當(dāng)見到細(xì)胞貼壁面的瓶壁出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時，棄去胰酶溶液，并加入適量培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。 ? 將細(xì)胞分裝至新鮮的培養(yǎng)液中，使細(xì)胞的最終數(shù)量調(diào)節(jié)至 1 105～ 3 105個 /mL。 六、思考題 ? 如何防止傳代過程的
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1