【正文】 度地升降，升或降的幅度不易被肉眼觀察到，適用于高倍鏡和油鏡焦 距的精細(xì)調(diào)節(jié)；也常用于觀察標(biāo)本的不同層次，一般在粗調(diào)螺旋調(diào)焦 的基礎(chǔ)上使用。③ 鏡臂 ：是支持鏡筒和鏡 臺的彎曲狀結(jié)構(gòu)，是取用顯微鏡時握持的部位。數(shù)值孔徑大的 高倍物鏡，其工作距離小。 (7) 工作距離：工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之 間的距離。由于蓋玻片的厚度不 標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生 了像差，這就是覆蓋差。視場數(shù)（Field Number, 簡寫為 FN），標(biāo)刻在目鏡的鏡筒外側(cè)。 (5) 視場直徑（Fieldof view）：觀察顯微鏡時，所看到的明亮的原形范圍叫 視場，它的大小，是由目鏡里的視場光闌決定的。放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放 大率越高越好，在選擇時應(yīng)首先考慮物鏡的數(shù)值孔徑。其數(shù)值的大 小，分別標(biāo)科在物鏡和聚光鏡的外殼上。② 提高NA值。顯微鏡的 分辨率用公式表示為：d=；λ為光線 的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑。 圖11 光學(xué)顯微鏡型號實例 2. 顯微鏡的一些基本知識 普通光學(xué)顯微鏡的基本工作原理是利用物鏡和目鏡的多組凸透鏡將物 像逐級放大并反射到視網(wǎng)膜上的過程。 實驗內(nèi)容和方法（1） 普通光學(xué)顯微鏡1. 顯微鏡的用途 顯微鏡是用來觀察、記錄和研究經(jīng)過制片技術(shù)處理后被檢物體細(xì)微結(jié)構(gòu) 的最主要的光學(xué)精密儀器。實驗一 普通光學(xué)顯微鏡及暗視野顯微鏡的使用一、實驗?zāi)康? 1. 強化普通光鏡結(jié)構(gòu)和使用技能的知識，掌握讓其發(fā)揮最佳效能的方法。細(xì)胞生物學(xué)實驗講義 吳錦程 梁 杰 編莆田學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)系生物技術(shù)專業(yè) 2009年2月目 錄1. 前言......................................................................................... 32. 實驗一 普通光學(xué)顯微鏡及暗視野顯微鏡的使用...... 43. 實驗二 熒光和相差顯微鏡及其使用.............. .164. 實驗三 細(xì)胞膜的滲透性.................................................. .235. 實驗四 細(xì)胞凝集反應(yīng)...................................................... .276. 實驗五 葉綠體的分離與熒光觀察................................... 297. 實驗六 線粒體與液泡的超活染色與觀察....................... 328. 實驗七 酸性磷酸酶的顯示方法 (選做）....................... .369. 實驗八 植物細(xì)胞原生質(zhì)流動及其影響因素 (選做）.... 3910. 實驗九 植物細(xì)胞骨架的觀察 (選做）............................ 41 前 言細(xì)胞生物學(xué)是當(dāng)前生命科學(xué)中核心學(xué)科之一，也是重要的專業(yè)基礎(chǔ)課，其理論與實驗技術(shù)已廣泛地用于研究細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)與克隆、病毒、細(xì)菌、胚胎發(fā)育、遠(yuǎn)緣雜交、人類疾病的發(fā)病機制、藥物機理等領(lǐng)域，隨著分子生物學(xué)的研究滲入，分子細(xì)胞生物學(xué)也得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。 2. 了解暗場顯微鏡的構(gòu)造和原理，并掌握它們使用方法。400多年來，經(jīng)不斷改進(jìn)，顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能 逐步完善，形成了品種繁多、型號各異的光學(xué)顯微鏡系列它廣泛地應(yīng)用于各 學(xué)科領(lǐng)域中，對微觀世界的探索及理論的研究起著極其重要的作用（如圖 11）。而顯微鏡的性能和質(zhì)量的高低可通過 分辨率、數(shù)值孔徑、總放大倍率等指標(biāo)來反映?？梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值 與照明光源的波長兩個因素決定。 ③ 消色差。這里必須指出，為了充分發(fā)揮 物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時，聚光鏡的NA值應(yīng)等于或略大于物鏡 的NA值，數(shù)值孔徑與其它技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系，它幾乎決定和影 響著其它各項技術(shù)參數(shù)。 (4) 焦深：焦深為焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當(dāng)焦點對準(zhǔn)某一物 體時，不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚，而且在此平面的上下 一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個清楚部分的厚度就是焦深。視場直徑也稱視場寬 度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實際范圍。由公式可看出：① 視場直徑與視場數(shù) 成正比；② 增大物鏡的倍數(shù)，則視場直徑減小。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成像質(zhì)量。鏡檢時，被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。 (8) 機械系統(tǒng)：① 鏡筒：是安裝在光鏡最上方或鏡臂前方的圓筒狀結(jié)構(gòu)或 方形結(jié)構(gòu)，其上端裝有目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相連（圖1—2）。④ 調(diào)焦器：也稱調(diào)焦 螺旋，是調(diào)節(jié)焦距的裝置，位于鏡柱的下端，左右對稱各一套。有些類型的光鏡，在左側(cè)粗調(diào)螺旋的內(nèi)側(cè)有一窄環(huán)， 稱為粗調(diào)松緊調(diào)節(jié)輪，其功能是調(diào)節(jié)粗調(diào)螺旋的松緊度。在載物臺上裝有標(biāo)本移動器，也稱推 進(jìn)器或推進(jìn)尺，其上安裝的彈簧夾用于固定玻片標(biāo)本，載物臺的左下 方的兩個螺旋可以移動推進(jìn)器，可使玻片標(biāo)本在水平面上前后左右移 動，用來尋找目標(biāo)。 (9) 光學(xué)系統(tǒng):光學(xué)系統(tǒng)包括目鏡和物鏡。另外，還可在光闌的面 上安裝目鏡測微尺。常用物鏡的放大倍數(shù)有“10 ”、“40 ”和“100 ”等幾種。由于玻璃與空氣的折光率不 同，光線通過載玻片和空氣進(jìn)入物鏡，部分光線產(chǎn)生折射而損失掉，導(dǎo) 致進(jìn)入物鏡的光線減少，分辨率降低。物鏡的放大倍數(shù)與其工作距離成反比。在聚光器的左下方，有一調(diào)節(jié)螺旋，可使其上升或下降，從而 調(diào)節(jié)光線的強弱。有的顯微鏡光圈的下方還裝有濾光片框，可放置不同顏色 的濾光片。燈泡在鏡座上 面中央位置，其開關(guān)在鏡座上鏡柱底部的左側(cè)（有的顯微鏡開關(guān)在鏡 柱上）。 (2) 低倍鏡的使用：① 調(diào)光：打開顯微鏡光源，轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋，使載物臺 稍下降，調(diào)節(jié)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡轉(zhuǎn)到工作狀態(tài)（即低倍鏡頭對準(zhǔn)通 光孔），當(dāng)鏡頭完全到位時，可聽到輕微的頓挫聲。③ 調(diào)焦：用眼睛從側(cè)面注視低倍鏡， 同時用粗調(diào)螺旋使載物臺上升，直至低倍鏡頭距玻片標(biāo)本的距離約 cm（注意操作時必須從側(cè)面注視鏡頭與玻片的距離，以避免鏡頭壓 壞玻片）；然后，雙眼觀察目鏡，同時慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋使載物臺下降， 直至視野中出現(xiàn)較清晰的物像為止；最后，轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)螺旋，使視野中的 物像更清晰。如果 移動標(biāo)本推進(jìn)器物像隨之移動，a. 轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器，使鏡臺細(xì)微上升，使 標(biāo)本上表面上的異物物像消失，進(jìn)而出現(xiàn)真正要觀察的標(biāo)本物像；b. 如 第a種方法仍不能看到真正的標(biāo)本物像，可繼續(xù)用粗調(diào)節(jié)器緩慢下降鏡 臺，使標(biāo)本下表面上的異物物像消失，直至看到真正的標(biāo)本物像；c. 如果第a和第b種方法都不行，應(yīng)重復(fù)調(diào)焦。此時不能硬轉(zhuǎn)，應(yīng)檢查玻片是否 放反、玻片是否過厚以及物鏡是否松動等情況。 雙眼注視目鏡的同時小心而緩慢地轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)螺旋，直至視野中出現(xiàn)清晰 的物像。擦 試前，應(yīng)將鏡筒升高約1 cm并將油鏡頭轉(zhuǎn)離通光孔；擦試時，先用擦鏡 紙蘸少許二甲苯擦2次，再用干凈的擦鏡紙擦1次。最 后，將顯微鏡罩上防塵罩，放在實驗臺正中央。 2. 光路的合軸調(diào)整 （1）聚光器的調(diào)中； （2）物鏡和目鏡的選用于組合； （3）光闌及其使用。暗視野顯微鏡由于不將透明光射入直接觀察系統(tǒng)，無物體時，視野暗黑，不可能觀察到任何物體；當(dāng)有物體時，以物體衍射回的光與散射光等在暗的背景中明亮可見。在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像．并非物體的本身，所以只能看到物體的存在和運動，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。m)所不具有的特性，可用以觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運動等,如圖14及15。擋光片是用來擋住光源中間的光線，讓光線只能從周圍射入標(biāo)本，大小約和光圈大小相同。 c. 在聚光器和標(biāo)本片之間要加一滴香柏油，目的是不使照明光線于聚光鏡上面進(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體，而得不到暗視野照明。 3. 實用范圍和實際應(yīng)用 暗視野顯微鏡常用來觀察未染色的透明樣品。這是一種病原體檢查，對早期梅毒的診斷有十分重要的意義。 實驗建議 1. 使用顯微鏡之前，應(yīng)熟悉顯微鏡的各部分名稱及使用方法。 2. 使用暗視野顯微鏡照明時，為什么必須在聚光器與載玻片之間進(jìn)行油浸？ 3. 實驗體會。三、實驗內(nèi)容和方法（一）相差顯微鏡的構(gòu)造、原理及使用方法 1. 原理 相差顯微鏡是荷蘭科學(xué)家Zernike于1935年發(fā)明的，用于觀察未染色標(biāo)本的顯微鏡。 相差是指同一光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。而相差顯微鏡就是利用被檢物的光程之差進(jìn)行鏡檢的。主要用于觀察活細(xì)胞或不染色的組織切片，有時也可用于觀察缺少反差的染色樣品。 　?、?相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。 2. 操作：（演示） ① 將燈室光圈和聚光鏡光圈都開至最大。這是轉(zhuǎn)盤上相環(huán)的影像, 用相環(huán)中心調(diào)節(jié)鈕使亮 環(huán)和黑環(huán)重合。 3. 在進(jìn)行顯微鏡操作的任何時段都禁止用手觸摸鏡頭, 也不要將鏡頭碰到蓋玻 片。熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍(lán)紫光、藍(lán)光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長較長的熒光。 熒光顯微鏡就其光路來分有兩種：① 透射式熒光顯微鏡: 激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光鈾呈45度角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。② 透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在 物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。使用中應(yīng)注意：未裝濾光片不要用眼直接觀 察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時，必須用無熒光的特殊油鏡；高 壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定， 影響汞燈壽命。有時需用石英玻璃載玻片。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。 7. 使用熒光顯微鏡的注意事項： ① 嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。 ④ 檢查時間每次以1—2 h為宜，超過90 min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降， 熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3—5 min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不 得超過2—3 h。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結(jié)果。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。3. 應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。 mm左右。8. 熒光標(biāo)本一般不能長久保存，若持續(xù)長時間照射（尤其是紫外線）易很快褪 色。標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護(hù)光源。 10. 標(biāo)本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。這樣，既可避免對標(biāo)本不 必要的長時間照射，又減少了開閉汞燈的頻率和次數(shù)。“+++”—可 見耀眼的熒光。 15. 熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進(jìn)行。實驗三 細(xì)胞膜的滲透性一、實驗?zāi)康?. 了解細(xì)胞膜對物質(zhì)通透性的一般規(guī)律。各種物質(zhì)出入細(xì)胞的方式是不