【正文】 臨床免疫定性試驗(yàn)結(jié)果判讀 泗陽(yáng)縣人民醫(yī)院 周育洋 今天的復(fù)習(xí)題 ? 簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)室選擇免疫定性檢測(cè)敏感性、特異性、預(yù)測(cè)值、符合率的原則，并舉例說(shuō)明。 ? 簡(jiǎn)述丙肝抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室診斷流程。 ? 簡(jiǎn)述造成 RPR試驗(yàn)假陽(yáng)性的一部分原因。 ? 本課件免疫定性試驗(yàn)僅指臨床通常使用的基于抗原 抗體反應(yīng)原理的試驗(yàn) ? 抗原 抗體反應(yīng)的特點(diǎn)： *特異性 *比例性 前帶（抗體多）后帶（抗原多） *可逆性 pH 離子強(qiáng)度 抗原抗體反應(yīng)類型 ? 沉淀反應(yīng) 可溶性抗原 ? 凝集反應(yīng) 顆粒性抗原 ? 補(bǔ)體參于的反應(yīng) ? 中和反應(yīng) ? 標(biāo)記免疫 熒光 放射 酶標(biāo) 發(fā)光 金標(biāo) 影響抗原 抗體反應(yīng)的因素 ? 反應(yīng)物自身的因素： 抗原： 可溶性 顆粒性 細(xì)菌 細(xì)胞 抗體： 來(lái)源 濃度 特異性 親和力 反應(yīng)環(huán)境條件： 電解質(zhì) 酸堿度 溫度 原材料 決定性 ? 抗原 – 類型：天然（自然生成，未經(jīng)修飾） 變性（或在其它方面改變） 合成（用片段和甚至是單獨(dú)的表位） – 純度：用于純化的方法應(yīng)盡可能的精密。 為了允許較小組分的檢測(cè)，應(yīng)該有足夠的量 – 亞型：全面性 – 突變：抗原性改變 影響因素 原材料 ? 抗體 – 類型：?jiǎn)慰寺?、混合單克隆、多克隆或單克?多克隆組合。 – 非特異活性：可以來(lái)自“異常”人免疫球蛋白，包括風(fēng)濕因子和異嗜性抗體（抗 反芻類、抗 鳥(niǎo)類或抗 鼠類）。 – 效價(jià)： 最佳反應(yīng)的工作稀釋度。推薦的稀釋度應(yīng)該只作為起始點(diǎn)被接受。 內(nèi)源性干擾因素 ?類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、治療性抗體、自身抗體、溶菌酶、磷脂、藥物小分子、總蛋白濃度等。 類風(fēng)濕因子（ RF）干擾 ? RF一般為 IgM型，亦有 IgG和 IgA型。 ? RF具有與變性 IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn)。 ? 在捕獲法 IgM型特異抗體的測(cè)定中表現(xiàn)最為明顯，因?yàn)榇藭r(shí)固相包被的抗體為抗人 181。鏈抗體， IgM型 RF的存在可使其大量結(jié)合于固相。 類風(fēng)濕因子干擾的排除 ? 稀釋標(biāo)本 ? 改變標(biāo)記抗體 ? 用變性 IgG預(yù)先封閉標(biāo)本中 RF ? 測(cè)抗原 ,可加入還原劑如 2巰基乙醇去除 RF ? 使用特異的雞抗體 IgY作為標(biāo)記或固相抗體 補(bǔ)體干擾 ? 固相抗體和標(biāo)記二抗的抗體分子可發(fā)生變構(gòu)，從而其 Fc段的補(bǔ)體 C1q結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來(lái)，這樣 C1q就成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來(lái)，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。 ? 固相抗體也會(huì)因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體的抗原表位結(jié)合能力，而引起假陰性結(jié)果或結(jié)果偏低。 補(bǔ)體干擾的排除 ? 56℃ 30min加熱可使標(biāo)本中補(bǔ)體C1q滅活 ?使用特異的雞抗體 IgY作為標(biāo)記或固相抗體 自身抗體干擾 ?自身抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等，能與其相應(yīng)靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在免疫測(cè)定方法中可干擾相應(yīng)抗原抗體的測(cè)定。 ?為避免以上情況出現(xiàn)，可在測(cè)定前用理化方法將其解離。 影響因素 反應(yīng)模式 ? 雙抗體（原）夾心法 ? 間接法 ? 競(jìng)爭(zhēng)法 ? 競(jìng)爭(zhēng)中和法 ? 捕獲法 ? 一步法的增強(qiáng)試劑聚乙二醇，用來(lái)增強(qiáng)抗原 抗體復(fù)合物的生成，加速非特異性綁定和反應(yīng)時(shí)間，但可以引起非免疫化學(xué)沉淀，降低試驗(yàn)的敏感性和特異性。 液液相技術(shù) 固液相技術(shù) 二步法 影響因素 信號(hào)放大系統(tǒng) ? 顯色劑： OPD， TMB ? 熒光： 4MUP ? 時(shí)間分辨：稀土元素 ? 化學(xué)發(fā)光：魯米諾，吖啶酯類，AMPPD ? 電化學(xué)發(fā)光：三甲基吡啶釕 外源性干擾因素 ?溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、凝固不全、反復(fù)凍融。 標(biāo)本溶血 ?注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血 。 ?血紅蛋白類似過(guò)氧化物的活性 ，使反應(yīng)顯色 。 標(biāo)本被細(xì)菌污染 ? 細(xì)菌的生長(zhǎng) ， 其所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用 。 ? 細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的 β 半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾 。 標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ? 標(biāo)本在 2～ 8℃ 下保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， IgG可聚合成多聚體，在間接法免疫測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深、甚至造成假陽(yáng)性。 ? 血清標(biāo)本如是以無(wú)菌操作分離，則可以在 2～ 8℃ 下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在－ 70℃ 以下。 標(biāo)本凝固不全 ? 血液采集后 ， 離心分離血清沒(méi)有完全凝固 ，離出的 “ 血清 ” 并非為完全的血清 ， 其中仍殘留部分纖維蛋白原 ， 易造成假陽(yáng)性結(jié)果 。 ? 血液標(biāo)本采集后 ， 應(yīng)使其充分凝固后再分離血清 ， 或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?。 冰凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融 ?反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用 ，從而引起假陰性結(jié)果 。 幾個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)概念 正態(tài)分布 (Gaussian distribution) ? 當(dāng)一質(zhì)控物用同一方法在不同的時(shí)間重復(fù)多次測(cè)定，且測(cè)定數(shù)據(jù)足夠多時(shí)，如以橫軸表示測(cè)定值，縱軸表示在大量測(cè)定中相應(yīng)測(cè)定值的個(gè)數(shù)，則可得到一個(gè)兩頭低，中間高，中為所有測(cè)定值的均值，左右對(duì)稱的 “ 鐘形 ” 曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。 ? 正態(tài)分布的基本統(tǒng)計(jì)學(xué)含義可用均數(shù)（ X）、標(biāo)準(zhǔn)差（ s）和概率來(lái)說(shuō)明。 重復(fù)性條件 ?是指在短的間隔時(shí)間內(nèi)，在同一實(shí)驗(yàn)室對(duì)相同的測(cè)定項(xiàng)目使用同一方法和同一儀器設(shè)備，由相同的操作者獲得獨(dú)立的測(cè)定結(jié)果的條件。 ? 診斷敏感性（ sensitivity of diagnosis） 是指將實(shí)際患病者正確地判斷為陽(yáng)性（真陽(yáng)性）的百分率。 ? 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（ positive predictive value, PPV） 是指特定試驗(yàn)方法測(cè)定得到的