【正文】 臨床免疫定性試驗結果判讀 泗陽縣人民醫(yī)院 周育洋 今天的復習題 ? 簡述實驗室選擇免疫定性檢測敏感性、特異性、預測值、符合率的原則，并舉例說明。 ? 簡述丙肝抗體檢測實驗室診斷流程。 ? 簡述造成 RPR試驗假陽性的一部分原因。 ? 本課件免疫定性試驗僅指臨床通常使用的基于抗原 抗體反應原理的試驗 ? 抗原 抗體反應的特點： *特異性 *比例性 前帶（抗體多）后帶（抗原多） *可逆性 pH 離子強度 抗原抗體反應類型 ? 沉淀反應 可溶性抗原 ? 凝集反應 顆粒性抗原 ? 補體參于的反應 ? 中和反應 ? 標記免疫 熒光 放射 酶標 發(fā)光 金標 影響抗原 抗體反應的因素 ? 反應物自身的因素： 抗原： 可溶性 顆粒性 細菌 細胞 抗體： 來源 濃度 特異性 親和力 反應環(huán)境條件： 電解質 酸堿度 溫度 原材料 決定性 ? 抗原 – 類型：天然（自然生成，未經修飾） 變性（或在其它方面改變） 合成（用片段和甚至是單獨的表位） – 純度：用于純化的方法應盡可能的精密。 為了允許較小組分的檢測，應該有足夠的量 – 亞型：全面性 – 突變：抗原性改變 影響因素 原材料 ? 抗體 – 類型：單克隆、混合單克隆、多克隆或單克隆 多克隆組合。 – 非特異活性：可以來自“異?！比嗣庖咔虻鞍祝L濕因子和異嗜性抗體（抗 反芻類、抗 鳥類或抗 鼠類）。 – 效價： 最佳反應的工作稀釋度。推薦的稀釋度應該只作為起始點被接受。 內源性干擾因素 ?類風濕因子、補體、異嗜性抗體、治療性抗體、自身抗體、溶菌酶、磷脂、藥物小分子、總蛋白濃度等。 類風濕因子（ RF）干擾 ? RF一般為 IgM型，亦有 IgG和 IgA型。 ? RF具有與變性 IgG產生非特異結合的特點。 ? 在捕獲法 IgM型特異抗體的測定中表現最為明顯，因為此時固相包被的抗體為抗人 181。鏈抗體， IgM型 RF的存在可使其大量結合于固相。 類風濕因子干擾的排除 ? 稀釋標本 ? 改變標記抗體 ? 用變性 IgG預先封閉標本中 RF ? 測抗原 ,可加入還原劑如 2巰基乙醇去除 RF ? 使用特異的雞抗體 IgY作為標記或固相抗體 補體干擾 ? 固相抗體和標記二抗的抗體分子可發(fā)生變構，從而其 Fc段的補體 C1q結合位點被暴露出來，這樣 C1q就成為一個中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現假陽性結果。 ? 固相抗體也會因為活化補體的結合，封閉抗體的抗原表位結合能力，而引起假陰性結果或結果偏低。 補體干擾的排除 ? 56℃ 30min加熱可使標本中補體C1q滅活 ?使用特異的雞抗體 IgY作為標記或固相抗體 自身抗體干擾 ?自身抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等，能與其相應靶抗原結合形成復合物，在免疫測定方法中可干擾相應抗原抗體的測定。 ?為避免以上情況出現，可在測定前用理化方法將其解離。 影響因素 反應模式 ? 雙抗體（原）夾心法 ? 間接法 ? 競爭法 ? 競爭中和法 ? 捕獲法 ? 一步法的增強試劑聚乙二醇，用來增強抗原 抗體復合物的生成，加速非特異性綁定和反應時間，但可以引起非免疫化學沉淀，降低試驗的敏感性和特異性。 液液相技術 固液相技術 二步法 影響因素 信號放大系統(tǒng) ? 顯色劑： OPD， TMB ? 熒光： 4MUP ? 時間分辨：稀土元素 ? 化學發(fā)光：魯米諾，吖啶酯類，AMPPD ? 電化學發(fā)光：三甲基吡啶釕 外源性干擾因素 ?溶血、細菌污染、標本貯存時間過長、凝固不全、反復凍融。 標本溶血 ?注意避免出現嚴重溶血 。 ?血紅蛋白類似過氧化物的活性 ，使反應顯色 。 標本被細菌污染 ? 細菌的生長 ， 其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用 。 ? 細菌的內源性酶如大腸桿菌的 β 半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾 。 標本貯存時間過長 ? 標本在 2～ 8℃ 下保存時間過長， IgG可聚合成多聚體，在間接法免疫測定中會導致本底過深、甚至造成假陽性。 ? 血清標本如是以無菌操作分離，則可以在 2～ 8℃ 下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在－ 70℃ 以下。 標本凝固不全 ? 血液采集后 ， 離心分離血清沒有完全凝固 ，離出的 “ 血清 ” 并非為完全的血清 ， 其中仍殘留部分纖維蛋白原 ， 易造成假陽性結果 。 ? 血液標本采集后 ， 應使其充分凝固后再分離血清 ， 或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當的促凝劑 。 冰凍保存標本避免反復凍融 ?反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用 ，從而引起假陰性結果 。 幾個統(tǒng)計學概念 正態(tài)分布 (Gaussian distribution) ? 當一質控物用同一方法在不同的時間重復多次測定，且測定數據足夠多時，如以橫軸表示測定值，縱軸表示在大量測定中相應測定值的個數，則可得到一個兩頭低，中間高，中為所有測定值的均值，左右對稱的 “ 鐘形 ” 曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。 ? 正態(tài)分布的基本統(tǒng)計學含義可用均數（ X）、標準差（ s）和概率來說明。 重復性條件 ?是指在短的間隔時間內，在同一實驗室對相同的測定項目使用同一方法和同一儀器設備，由相同的操作者獲得獨立的測定結果的條件。 ? 診斷敏感性（ sensitivity of diagnosis） 是指將實際患病者正確地判斷為陽性（真陽性）的百分率。 ? 陽性預測值（ positive predictive value, PPV） 是指特定試驗方法測定得到的