【正文】 就能依次從層析柱中分離出來。交換基團(tuán)(由能起交換作用的陽(陰)離子（Ｈ＋）和與交換樹脂本體聯(lián)結(jié)在一起的陰(陽)離子（SO3）兩部分組成（磺酸基）。采用的生產(chǎn)菌主要有谷氨酸棒桿菌和黃色短桿菌的代謝調(diào)節(jié)突變株賴氨酸生物合成途徑及調(diào)節(jié)機(jī)制二氨基庚二酸途徑　　細(xì)菌、綠藻、原生蟲和高等植物中α－氨基己二酸途徑　　酵母、霉菌中賴氨酸生產(chǎn)菌育種途徑一、 優(yōu)先合成轉(zhuǎn)換　　降低高絲氨酸脫氫酶活性二、 切斷支路代謝　　營養(yǎng)缺陷型的選育（通過誘變使高絲氨酸脫氫酶缺失，切斷向蘇氨酸和蛋氨酸的代謝流）三、 抗結(jié)構(gòu)類似物菌株的選育四、 解除代謝互鎖五、 選育亮氨酸缺陷型菌株六、 選育抗亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物菌株七、 選育對苯醌或喹啉衍生物敏感株八、 增加前體物的合成和阻塞副產(chǎn)物的生成九、 切斷或削弱支路代謝流a) 切斷或削弱合成賴氨酸的支路：選育賴氨酸缺陷型（Lys－）或賴氨酸滲滲漏型（Lys1）或賴氨酸缺陷型回復(fù)突變株(Lys+)b) 切斷或削弱合成蛋氨酸的支路：選育蛋氨酸缺陷型或蛋氨酸滲滲漏型或蛋氨酸缺陷型回復(fù)突變株c) 切斷由蘇氨酸到異亮氨酸的反應(yīng)：選育異亮氨酸缺陷型十、 解除蘇氨酸生物合成途徑中的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制a) 解除蘇氨酸＋賴氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制b) 解除蘇氨酸對高絲氨酸脫氫酶的反饋抑制，選育抗蘇氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株c) 選育抗賴氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株十一、 增加前體物天冬氨酸的合成和阻塞副產(chǎn)物生成a) 選育丙氨酸缺陷型突變株b) 選育抗天冬氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株c) 選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株蘇氨酸高產(chǎn)菌株的生物特征二氫吡啶2,6二羧酸合成酶活力極弱或欠缺琥珀酰高絲蛋氨酸合成酶活力極弱或欠缺蘇氨酸脫氨酶極弱或欠缺CO2固定反應(yīng)能力強(qiáng)天冬氨酸合成能力強(qiáng)天冬氨酸激酶活力強(qiáng)，對Thr+Lys的協(xié)同反饋抑制不敏感高絲氨酸脫氫酶活力強(qiáng)，不受蘇氨酸反饋調(diào)節(jié)高絲氨酸菌種的選育途徑切斷或削弱支路代謝切斷高絲氨酸往下的代謝反應(yīng)解除反饋調(diào)節(jié)增加前體物質(zhì)的合成蛋氨酸的育種途徑o 切斷支路代謝n 切斷或削弱通向賴氨酸的代謝支路n 切斷或削弱通往合成蘇氨酸的代謝支路n 切斷蛋白氨酸生成S－腺苷蛋氨酸的反應(yīng)n 解除反饋調(diào)節(jié)n 增加前體物質(zhì)的合成高產(chǎn)蛋氨酸菌種應(yīng)具備的生化特征o 二氨吡啶二羧酸合成酶極弱或欠缺o 高絲氨酸激酶極弱或欠缺o S－腺苷蛋氨酸合成酶欠缺o 二氧化碳固定反應(yīng)強(qiáng)o 天冬氨酸合成能力強(qiáng)o 天冬氨酸激酶活力強(qiáng)o 高絲氨酸脫氫酶活力強(qiáng)，此酶對蘇氨酸、異亮氨酸的反饋抑制不敏感，也不受蛋氨酸的反饋調(diào)節(jié)。（王鏡巖　生物化學(xué)　P356）其生產(chǎn)方法有合成法、蛋白質(zhì)水解法和微生物發(fā)酵法。n 苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成n 色氨酸的生成分支酸（chorismate）在分支酸變位酶（chorismate mutase）作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)轭A(yù)苯酸(prephenate), 經(jīng)脫水、脫羧后形成苯丙酮酸（phenylpyruvate）,后者在轉(zhuǎn)氨酶作用下，與谷氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨形成苯丙氨酸。o 選育抗色氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株。（2）發(fā)酵液除雜：通過加草酸、過濾等方法除去無機(jī)離子、菌體等。（4）控制晶體生長速度、過飽和度、pH等調(diào)整晶體形狀，使之均一。檸檬酸的生產(chǎn)方法概述n 水果提取法：此法提取的成本較高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。 n 生物發(fā)酵法：q 表面發(fā)酵法：又稱淺層發(fā)酵法，多以甜菜糖蜜為原料。q 深層發(fā)酵法：q 固態(tài)發(fā)酵法：以薯干粉及其它含淀粉的農(nóng)副產(chǎn)品為原料，配好培養(yǎng)基后，在常壓下蒸煮，冷卻至接種溫度，接入種曲，裝入曲盤，在一定溫度和濕度條件下發(fā)酵。檸檬酸發(fā)酵機(jī)制n 關(guān)于檸檬酸發(fā)酵的機(jī)制有多種理論，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為它與三羧酸循環(huán)有密切的關(guān)系。n 檸檬酸的溢出代謝：q 多種微生物均能因受刺激而過量合成檸檬酸。黑曲霉之所以能在特定環(huán)境條件下累積檸檬酸，是因為在這種環(huán)境條件下代謝途徑前段的運(yùn)轉(zhuǎn)速率大于后段的運(yùn)轉(zhuǎn)速率。檸檬酸生物合成中的代謝調(diào)節(jié)與控制——追求檸檬酸的高產(chǎn)率 檸檬酸是微生物生長代謝過程中的一個中間性產(chǎn)物，在正常的微生物體內(nèi)不能夠積累的，如果有積累的話，與檸檬酸合成有關(guān)的各種酶的活性，則會受到抑制或阻遏，磷酸果糖激酶（PFK）活性的調(diào)節(jié) 研究表明，檸檬酸產(chǎn)生菌——黑曲霉如果生長在Mn+ 缺乏的培養(yǎng)基中，NH4+濃度異常的高，可達(dá)到25mmol/L，顯然，由于Mn+的缺乏，使得微生物體內(nèi)NH4+濃度升高，進(jìn)而解除了檸檬酸對PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不斷的合成大量的檸檬酸。通常檸檬酸產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的活性本身就要求很弱，但在發(fā)酵過程中仍需要控制它的活性。因此，檸檬酸發(fā)酵要求采用不銹鋼反應(yīng)器，目的就是控制培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度。 207。 許多實(shí)驗指出順烏頭酸酶活力變化與檸檬酸累積有密切關(guān)系。 添加順烏頭酸酶抑制劑可促進(jìn)檸檬酸積累。能荷調(diào)節(jié)對檸檬酸發(fā)酵的影響菌體要大量合成檸檬酸，從葡萄糖經(jīng)過EMP到檸檬酸整個代謝途徑需要暢通，在這個過程中：丙酮酸氧化脫羧，每分子丙酮酸可產(chǎn)生一分子的NADH，在有氧的條件下，每分子的NADH經(jīng)過呼吸鏈徹底氧化成H2O，并氧化磷酸化產(chǎn)生3分子的ATP，造成了微生物體內(nèi)能荷的增加，能荷增加則抑制PFK等關(guān)鍵酶的酶活性，使得從葡萄糖到檸檬酸的代謝停止，怎么能夠大量合成檸檬酸n 檸檬酸產(chǎn)生菌可在有氧的條件下大量生成檸檬酸，也就是說，NADH即被氧化了，又沒有產(chǎn)生ATP。n 標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈的存在使得菌體在代謝過程中產(chǎn)生了大量的ATP，用于菌體自身的生長上，這種現(xiàn)象，在生產(chǎn)上通常稱之為：只長菌不產(chǎn)酸 ，大量的葡萄糖被消耗了，卻沒有生產(chǎn)出檸檬酸，是一種失敗，（大型檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)需要自己備用的發(fā)電系統(tǒng)）。丙酮酸氧化脫酸生成乙酰CoA和CO2固定兩個反應(yīng)的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了合成檸檬酸能力。檸檬酸積累的理想條件：提高磷酸果糖激酶的活性提高丙酮酸羧化酶的活性提高檸檬酸合成酶的活性抑制順烏頭酸酶的活性抑制異檸檬酸脫氫酶的活性抑制a酮戊二酸脫氫酶的活性抑制異檸檬酸裂解酶的活性檸檬酸發(fā)酵需要下述環(huán)境條件 (1)磷酸鹽濃度低；(2)氮源用NH4+鹽；(3)pH值低（）；(4)溶氧量高；(5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量極低。，能產(chǎn)生和分泌大量的酸性α淀粉酶和酸性糖化酶。4. 細(xì)胞內(nèi)有較高水平的氨基酸、NH4+，即NH4+庫水平高。，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸水平低。搖瓶篩選與性能測定采用上述的分離培養(yǎng)基和分離篩選方法．參考高產(chǎn)菌的形態(tài)特征，從分離篩選平板上，挑出單一菌落，移接于麥芽汁瓊脂斜面上，于33℃培養(yǎng)6~7d。n 黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的保藏3. 真空冷凍干燥保藏法(196℃)保藏法目前檸檬酸的生產(chǎn)都是采用微生物發(fā)酵法。工業(yè)生產(chǎn)方法主要有深層液體發(fā)酵法、淺盤液體法以及固體原料的淺層制曲或厚層通風(fēng)制曲法。q (1)淀粉原料的液化 q 目前檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)均采用酶法進(jìn)行液化。出于淀粉酶能隨機(jī)切斷淀粉分子內(nèi)的α1，4糖苷鍵，使淀粉分子斷裂淀粉糊聯(lián)度迅速下降。通常液化終點(diǎn)是控制在料液與碘反應(yīng)不且藍(lán)色為止，對于以淀粉為原料的檸檬酸生產(chǎn)菌種，液化液的DE值在20%左右即可。糖蜜是甘蔗或甜菜制糖后的剩余物，除含有豐富的糖分外，還含有大量的金屬離子以及硫胺素、核黃素等生長因子。因此在發(fā)酵前糖蜜需要進(jìn)行預(yù)處理：q 糖密預(yù)處理的方法很多，最常用的方法是添加黃血鹽[亞鐵氰化鉀，k4(CN)6Fe3]或者經(jīng)硫酸、磷酸處理，也可添加活性炭、EDTA、單寧、石灰以及通過離子交換樹脂等，還可采用幾種方法交替處理。前者除要提供碳(能)源物質(zhì)外，還需一定的氮源和其他生長因子，出于過量含氮物質(zhì)不利于檸檬酸的產(chǎn)生，因此檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分是碳水化合物。發(fā)酵的技術(shù)關(guān)鍵是兼顧糖化和產(chǎn)酸，n 要解決兩者矛盾，可采用下列方法：q (1)采用酸性平扳馴化，分離在高檸檬酸濃度下糖化酶活力高酌菌株；q (2)通過調(diào)節(jié)風(fēng)量來控制，通常在16~18h前控制低風(fēng)量，使pH維持在有利于菌種生長和糖化作用的范圍。除檸檬酸外，還包括菌體、殘?zhí)恰⒌鞍踪|(zhì)、色素、膠體、有機(jī)雜酸、無機(jī)鹽等多種雜質(zhì)，總的來說，它們來源于原材料、未消耗的營養(yǎng)鹽或發(fā)酵的中間副產(chǎn)物，所以從檸檬酸發(fā)酵液中提取檸檬酸是比較困難的。 中和n ）工序的主要目標(biāo)q (1)從發(fā)酵清濾液中提取高純度的四水檸檬酸鈣q (2)檸檬酸鈣要易過濾和洗滌；q (3)廢水中檸檬酸鈣沉淀要限制在最低程度；q (4)盡可能減少洗糖水量，把檸檬酸鈣的溶損減少到允許范圍。n 凈化工藝包括脫色和離子交換樹脂除去雜質(zhì)離于：n 粗檸檬酸液炭柱陽離子柱陰離子柱精液n 酸解液中含有色素物質(zhì)，可用活性炭脫色去除。但是日前多數(shù)工廠都用顆粒活性炭柱進(jìn)行脫色，炭柱可再生重復(fù)使用。通過陽離于交換柱可除去Ca2+、Fe2+等陽離子，最常用的陽離子交換樹脂是732樹脂，檸檬酸被進(jìn)入陽離子交換往后應(yīng)控制一定流速并定時用黃血鹽和酒精分別檢測流出液中有無Fe2+和Ca2+ ，若出現(xiàn)Fe2+或Ca2+則應(yīng)立即停止進(jìn)料。n ．結(jié)晶n 本工序的主要目標(biāo)q (1)及時地從檸檬酸濃縮液中結(jié)晶出品體并分出母液q (2)濕檸檬酸晶體要粒度均勻，理化指標(biāo)符合等級標(biāo)準(zhǔn)，游離水含量盡可能低q (3)保持較高的結(jié)晶牢率和結(jié)晶收率；q (缺陷日益顯露：q 一是得到的提取液中檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，一般低于20%，增大了后續(xù)濃縮段的負(fù)荷；q 二是單元操作損失多，總收率低，國內(nèi)廠家一般在60%~75%。q 另外還有提取工藝長、工人勞動強(qiáng)度大、工作環(huán)境惡劣、提取設(shè)備腐蝕嚴(yán)重等缺點(diǎn)。n 離子交換吸附法是利用特定的有機(jī)高分子樹脂對檸檬酸或檸檬酸鹽的高選擇性，將檸檬酸或檸檬酸鹽從發(fā)酵液中提取出來的方法。n 國內(nèi)一般的流程是發(fā)酵液過濾后用離子交換柱提取，氨水洗脫后用陽離子交換柱轉(zhuǎn)型，經(jīng)脫色和除雜質(zhì)后濃縮和結(jié)晶.n 電滲析法提取葡萄糖糖蜜發(fā)酵液的工藝流程如圖4所示．發(fā)酵液（pH=～）經(jīng)過濾預(yù)處理后，用電滲析器分離，并濃縮2倍，這種粗提取液再利用活性炭和離子交換除去色素和雜質(zhì)離子，得到淡黃色、高純度檸檬酸水溶液 在檸檬酸提取中使用超濾、納濾和微濾l 氨基酸發(fā)酵的特點(diǎn)216。在脫氧核糖核酸(DNA)的分子水平上改變、控制微生物的代謝,使有用產(chǎn)物大量生成、積累。 代謝控制發(fā)酵（又稱新型發(fā)酵）216。 菌種：細(xì)菌216。216。探求新工藝、新設(shè)備,以提高產(chǎn)率和收得率。 研究發(fā)酵機(jī)制等問題,以便能更好地控制氨基酸這樣微生物中間代謝產(chǎn)物的發(fā)酵216。H2O | NH2性狀：無色柱狀結(jié)晶或粉末。 糖化車間216。 提取車間216。l 工藝（玉米淀粉） （除雜）l 目的：清除雜質(zhì)浸泡l 目的：（1）軟化（2）溶解（3）除雜l 工藝條件 溫度：5055℃ 時間：48h %l 目的：粉碎成10塊以上的小塊l 目的：分離胚芽l 目的：破壞細(xì)胞組織，釋放淀粉。l 原理：利用相對密度不同。l 帶式干燥機(jī)l 粉碎和篩分。中和的溫度控制在7080℃。谷氨酸的生物合成途徑 主要包括EMP、HMP、TCA循環(huán)、乙醛酸循環(huán)、CO2固定反應(yīng)。 谷氨酸生產(chǎn)菌應(yīng)具備的生化特點(diǎn)l 控制細(xì)胞膜通透性的方法1）生物素缺陷型 生物素（維生素H、輔酶R）作為輔酶參與脂肪酸的合成，進(jìn)而影響磷脂合成。 控制關(guān)鍵：生物素亞適量（510μg/L）216。應(yīng)用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌l 應(yīng)用原生質(zhì)體融合新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌l 應(yīng)用轉(zhuǎn)化法選育谷氨酸生產(chǎn)菌l 應(yīng)用轉(zhuǎn)導(dǎo)法選育谷氨酸生產(chǎn)菌l 應(yīng)用重組DNA技術(shù)構(gòu)建谷氨酸工程菌l 應(yīng)用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸216。l 溫度 避免溫度過高和波動較大l pH 0時不宜過高，培養(yǎng)結(jié)束不易過低l 溶解氧 溶氧水平不易過高。光密度：殘?zhí)牵海ヒ韵? 無菌檢查：()噬菌體檢查：()(雙層平板法、劃線法、液體培養(yǎng)法）鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽性反應(yīng)。光密度：殘?zhí)牵海ヒ韵? 無菌檢查：()噬菌體檢查：()(雙層平板法、劃線法、液體培養(yǎng)法）鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽性反應(yīng)。供氧對谷氨酸發(fā)酵的影響 菌體生長期：滿足菌體合成的需要，過低，副產(chǎn)物增加，影響菌體收率。 產(chǎn)酸期：最大滿足呼吸需氧量。l 糖流加方式 連續(xù)流加 分段加入l 提高發(fā)酵產(chǎn)率的主要措施一、選育優(yōu)良菌株二、改進(jìn)發(fā)酵工藝,連續(xù)流加糖發(fā)酵,使發(fā)酵工藝最佳化l 噬菌體檢查方法l 雙層平板法l 劃線法l 液體培養(yǎng)法l 將谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵液中積累的L谷氨酸提取出來,再進(jìn)一步中和、除鐵、脫色、加工精制成谷氨酸單鈉鹽叫提煉。 分為：提取和精制216。216。216。影響谷氨酸結(jié)晶的主要因素216。 谷氨酸濃度216。 加酸速度216。 殘?zhí)莑 離子交換法提取谷氨酸的原理 當(dāng)pH＞，谷氨酸以GA存在 當(dāng)pH＞，谷氨酸以GA+存在 可以用陽離子樹脂提取谷氨酸l 陽離子樹脂吸附順序： Ca2+＞ Mg2+ ＞ K+ ＞ NH4+ ＞ Na+ ＞丙氨酸＞亮氨酸＞谷氨酸＞天冬氨酸吸附（目的物的分離） ↓ 清洗（清除雜質(zhì)）