【正文】 。 ? 培養(yǎng)溫度一般為 28?C。 （二）液體種子制備 好氧培養(yǎng)： 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（ S. griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（ S. Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。 試管 → 三角瓶 → 搖床 → 種子罐 厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 試管 → 三角瓶 → 卡式罐 → 種子罐 二、生產(chǎn)車間種子制備 ?實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。 種子罐級數(shù)的確定 ? 種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)， 一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)。 ? 細菌：生長快 ， 種子用量比例少 ， 級數(shù)也較少 ， 二級發(fā)酵 。 ?確定種子罐級數(shù)需注意的問題 ? 種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會 ? 種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會 ? 雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。 ? 例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。 ? 原材料質(zhì)量的波動，起它要作用的是其中無機離子含量不同，如微量元素 Mg2+ 、 Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。 ?水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，影響種子質(zhì)量。 ?措施 ? 培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用 ? 嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量 ? 斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時間 ? 供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機氮源 培養(yǎng)條件 （ 1）溫度 溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。一般各生產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時發(fā)現(xiàn)： 在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。從表中看出相對濕度在 40%~45%時孢子數(shù)量最多，且孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。 （ 2）冷藏時間 ? 斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。而培養(yǎng) 5天以后冷藏， 20天未發(fā)現(xiàn)自溶。 例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在 6? C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低 18%，冷藏 3個月后降低 35%。 二、影響種子質(zhì)量的因素及控制 ?孢子的質(zhì)量 ?培養(yǎng)基 ?培養(yǎng)條件 ?種齡 ?接種量 培養(yǎng)基 ?營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要 ? 選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基； ? 營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用； ? 營養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高 ?營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。 ? 通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。 ? 不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。 接種量 ? 接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。 生化指標(biāo) ?種子液的糖、氮、磷的含量和 pH變化。 酶活力 ?種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。所以菌種保藏是進行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。 二、菌種保藏的原理 ? 菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。 ? 一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟，以便生產(chǎn)上能推廣使用。 一般保存期為三個月到六個月 。此法可 通用于不能利用石蠟油作碳源的細菌、霉菌、酵母等微生物的保存 。 三、菌種保藏的方法 C 沙土管保藏法（ 細菌，霉菌，防線菌 ） 這是國內(nèi)常采用的一種方法。它的 制備方法 是： 首先 ， 將沙與土 洗凈烘干過篩 后 ， 按沙與土的比例為 l－ 2∶ l混合均勻 ， 分裝于小試管中 ， 裝料高度約為 1厘米左右 ，121176。 一般 沙用 80目過篩 ， 土用 30－ 100目過篩 。 一般 保存期為 1年左右 。其 基本原理 是在較低的溫度下 （－ 15℃ ） ，快速她將細胞凍結(jié)，并且保持細胞完整，然后在真空中使 水分升華 。 因此，菌種可以保存很長時間， 一般 5年左右 。所以，國內(nèi)外都已較普遍地應(yīng)用。 保護劑一般采用脫脂牛奶或血清 。 保護劑還可以起 支持作用 ，使微生物疏松地固定在上面。 尤其是一些 不產(chǎn)孢子的菌絲體 ， 用其它保藏方法不理想 ， 可用 液氮保藏法 。 a 原理 用液氮能長期保存菌種。 b 操作方法及步驟 （ 1） 安瓿管要求 由于液氮保存于超低溫狀態(tài) ， 所使用的 安瓿管需能承受大的溫差而不致于破裂 ， 一般用 95料或 GCl7的玻璃管 ， 安瓿管選好后 印上標(biāo)記 ， 加棉塞后滅菌 ， 烘干后備用 。所以也需要 保護劑 ，常用的 保護劑為 10％甘油 。 （ 3） 凍結(jié) 液氮法的 關(guān)鍵 是 先把微生物從常溫過渡到低溫 。 美國 ATCC采用 先將菌液降溫到 0℃ ， 再以 每分鐘降低 1℃ 的速度 ， 一直降低到－ 38℃ ， 然后才把裝有菌液的安瓿管放入 液氮罐的氣相中 。所以要 常常注意液氮的殘存量 ， 定期補加 。 我國國內(nèi)目前已有 部分單位采用液氮法保存菌種 。 ? 菌種退化的原因 ? 基因突變； ? 變異菌株性狀分離； ? 誘變的單菌落是由 —個以上孢子或細胞形成 ? 菌落由 —個孢子或單個細胞形成，但它是多核細胞 ? 單核孢子發(fā)生突變時，雙鏈 DNA上僅 —條鏈上某個位點發(fā)生變化 ? 連續(xù)傳代 ? 其它因素 ? 菌種保藏不當(dāng) ? 生長條件不滿足（培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件） ?防止菌種退化的措施 ? 控制傳代次數(shù) ? 選擇合適的培養(yǎng)條件 ? 選擇合適的保藏方法 ? 菌種穩(wěn)定性檢查 ? 分離復(fù)壯 菌種復(fù)壯 使衰退的菌種重新恢復(fù)原來的優(yōu)良特性。 什么是微生物的初篩？請例舉兩種初篩方法，并簡述之。 常見的菌種復(fù)壯措施有哪些？