xxxx年本科實驗四重組質(zhì)粒dna提取、雙酶切鑒定-在線瀏覽
2025-02-15 11:10本頁面
【正文】 宿主菌染色體 DNA通常比質(zhì)粒 DNA要大得多 ★ 純化分離的宿主菌 DNA多為線性分子，而質(zhì)粒 DNA呈閉合環(huán)的形式。 根據(jù)質(zhì)粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 純化方法等因素綜合后加以選擇。 核酸分離純化的總原則： ? (1) 保證核酸一級結(jié)構(gòu)完整 ? (2) 排除其他分子的污染（蛋白質(zhì)、脂類、 糖、 有機溶劑、金屬離子、其他 DNA、 RNA等） 3. SDS堿裂解法提取 Puc119U6重組質(zhì)粒DNA 實驗原理： 高堿 細菌的細胞壁破裂，內(nèi)容物釋放 ①染色體 DNA斷裂成不同長度的線性雙鏈 DNA； ②線性雙鏈 DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。 高酸中和至中性 變性的染色體 DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物 質(zhì)粒 DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中 純化 RNA酶消化除去 RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì) 主要試劑及作用 溶液 Ⅰ ：由葡萄糖 、 EDTA、 Tris?HCl組成 .(保護 、 緩沖 ) ① 葡萄糖 的作用是增加溶液的粘度 ,減少抽提過程中的 機械 剪切作用 ,防止破壞質(zhì)粒 . (保護作用 ) ② EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子 , 防止 DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用。 ② KAC會與 SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成 沉淀而除去；溶液中的 DNA也會與蛋白質(zhì) SDS 復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒 DNA分離。l 溶液 I， 劇烈振蕩 EP管，室溫放置 3min 加入 200181。l 冰 溶液 III，溫和振蕩 10s，冰浴 5min， 12023rpm 5min 轉(zhuǎn)移上清 500181。l的 酚與 氯仿 /異戊醇的混合物（ 1:1混合） ，充分顛倒混勻， 4 ℃ 12023rpm 5min 400181。l氯仿 /異戊醇 ，顛倒混勻，4 ℃ 12023rpm ?5min 400181。l無水乙醇 ，顛倒混勻， 20 ℃ 冰箱中放置 15min， 4 ℃ 12023rpm ?10min 棄上清，沉淀中加 1ml 70%乙醇 ， 4 ℃ 12023rpm 5min 去上
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