質(zhì)粒dna提取純化與驗(yàn)證-在線瀏覽
2024-07-30 05:09本頁(yè)面
【正文】 DNA變性。TAE緩沖液緩沖能力弱，長(zhǎng)時(shí)間電泳緩沖能力逐漸喪失（陽(yáng)極變堿性，陰極變酸性），長(zhǎng)時(shí)間電泳需要更換緩沖液。 6)溫度：瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，不同大小DNA片段的相對(duì)電泳遷移率在4～30℃內(nèi)無變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進(jìn)行，而當(dāng)瓊脂糖含量少于0．5％時(shí)，凝膠很脆弱，最好在4℃下電泳以增加凝膠強(qiáng)度。Maker: λ/Hind III DNA Maker DL2000 DNA Maker 點(diǎn)樣對(duì)照組： pUC19/ Hind II雙鏈線性DNA PUC19（商品） λDNA 實(shí)驗(yàn)試劑LB培養(yǎng)基，抗生素（氨芐青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，3mol/L NaAc溶液，預(yù)冷無水乙醇，70%乙醇溶液，RNase A母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇(PCI)混合液，TAE電泳緩沖液（10），溴化乙錠（EB)，上樣緩沖液（6）。(1M TrisHCl， pH ； EDTA 10ml pH ，加ddH2O至500ml。溶液Ⅱ： NaOH，1% SDS。溶液Ⅲ：5M醋酸鉀（KAc）緩沖液60ml，溶液中濃度K+3M,Ac5M。2）對(duì)50mL的離心管稱重（記為m1），取菌液30ml配平，6000rpm離心5min，棄去上清液；加入5ml溶液Ⅰ混勻，6000rpm離心5min,棄去上清液。提取質(zhì)粒 1）向離心管中加入溶液Ⅰ（），漩渦混勻后，冰浴5min； 向離心管中加入溶液Ⅱ（），輕柔顛倒混勻后，冰浴5min； 向離心管中加入溶液Ⅲ（），輕柔顛倒混勻后，冰浴5min；離心管配平，12000rpm離心15min,取上清至新50ml離心管（記體積為v1) 2）加入2v1冰乙醇，顛倒混勻，20℃保存30min，12000rpm離心15min,棄上清液,將離心管倒置于紙巾上，以使所有液體流出。 純化質(zhì)粒 1）將提取物等分為500ul置于EP管中，加等體積酚液，混勻后，12000r離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管；加入等體積酚/氯仿/異戊醇(PCI)混合液，混勻后，12000rpm離心5min,轉(zhuǎn)上清至新EP管；加入等體積氯仿/異戊醇混合液，混勻后，12000rpm離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管； 2）加入1/10體積的3mol/L NaAc，混勻后，加入2倍體積（包括上清液和1/10體積的NaAc)的冰乙醇，顛倒混勻，20℃保存30min，12000rpm離心15min,棄去上清液；加入5mL70%乙醇進(jìn)行洗滌，12000rpm離心2min,棄去上清液，重復(fù)洗滌一次； 37℃下保存5min,至沉淀干燥,每管加入25ul TE溶液,溫和振蕩幾秒鐘，至沉淀溶解。凝膠電泳分離質(zhì)粒 1）制膠：1% 瓊脂糖凝膠：，加40ml 1TAE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，三角瓶放在手面可堅(jiān)持1min即可，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1TAE），即可上樣。點(diǎn)樣完畢后，100V，200mA條件下電泳30min?！咀⒁馐马?xiàng)】在接菌時(shí)，注意無菌操作，物品應(yīng)在酒精燈火焰上方無菌區(qū)域內(nèi)。注意離心機(jī)的使用，離心管要配平，以防錯(cuò)誤操作損壞離心機(jī)。為獲得高純度質(zhì)粒DNA，必須徹底除去雜蛋白、染色體DNA和RNA。加入溶液Ⅰ時(shí)，可劇烈震蕩，使菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻的菌懸液，此時(shí)細(xì)胞尚未破裂，染色體不會(huì)斷裂；加入溶液Ⅱ時(shí)，菌液變粘稠、透明，無菌塊殘留；加入溶液Ⅲ時(shí)，會(huì)立即出現(xiàn)白色沉淀。因此，操作時(shí)一定要緩慢柔和，采用上下顛倒的方法，既要使試劑與染色體DNA充分作用，又不破壞染色體的結(jié)構(gòu)。皮膚如不小心沾到酚，應(yīng)立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。除用乙醇沉淀DNA外，還可使用0．6倍體積的異丙醇，但異丙醇也能將鹽等雜質(zhì)沉淀，所以沉淀需要在常溫下進(jìn)行，并且時(shí)間不宜太長(zhǎng)(限20 min內(nèi))。、在低溫下提取質(zhì)粒DNA，收率較高。 制備凝膠時(shí)，應(yīng)避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時(shí)間過長(zhǎng)，否則溶液將會(huì)爆沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度，可在微波爐中間歇性加熱，約沸騰三次后，至凝膠溶解即可。電泳時(shí)最好使用新的電泳緩沖液，以
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