dna與rna提取方法及原理與提取方法及原理dna提取專題dna提取專題第一部分-在線瀏覽
2025-07-25 13:32本頁(yè)面
【正文】 的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。 代替乙醇沉淀DNA DNA： DNA液中加入 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入 冰浴20min 20min。 核酸分離、 核酸分離、純化多酚的去除： 多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β巰基乙醇、 巰基乙醇、 抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 抗壞血酸、半胱氨酸、 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 加入易與酚類結(jié)合的試劑： PVP、PEG(聚乙二醇) 聚乙二醇 們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA DNA的結(jié)合 們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合 鹽離子的去除： 鹽離子的去除： 70％ 70％的乙醇洗滌 核酸沉淀、 核酸沉淀、溶解基因組DNA的提取 基因組DNA的提取 DNA 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 DNA 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀， 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀， 沉淀會(huì)更充分 沉淀時(shí)加入1/10體積的 體積的NaOAc（，3M），有 ），有 沉淀時(shí)加入 體積的 （ ， ）， 利于充分沉淀 沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌， 沉淀后應(yīng)用 ％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥） ，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥） 晾干 若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解 若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用 緩沖液溶解 ? ? TE中的 中的EDTA能螯和 2+或Mn2+離子，抑制 能螯和Mg 離子，抑制DNase 中的 能螯和 pH值為 ，可防止 ，可防止DNA發(fā)生酸解 值為 發(fā)生酸解 基因組DNA的檢測(cè) 基因組DNA的檢測(cè)提取的基因組DNA片段在 片段在20kb－30kb之間 提取的基因組 片段在 － 之間 高質(zhì)量的基因組DNA帶型 單一無(wú)拖尾現(xiàn)象 帶型 高質(zhì)量的基因組 DNA濃度及純度的檢測(cè) A260=1 約 50 ?g/ mL 雙鏈 濃度及純度的檢測(cè) 雙鏈DNA； ； A260/280 約為 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題一：DNA樣品不純 抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。 原因 1. 2. 3. 4. DNA中含有蛋白、多 DNA中含有蛋白、 中含有蛋白 糖、多酚類雜質(zhì) DNA在溶解前 在溶解前， DNA在溶解前，有酒 精殘留， 精殘留，酒精抑制 后續(xù)酶解反應(yīng) DNA中殘留有金屬離 DNA中殘留有金屬離 子 RNA的存留 有RNA的存留 1. 對(duì) 策 2. 3. 4. 重新純化DNA， 重新純化DNA，過(guò)吸附 DNA 柱去除蛋白、多糖、 柱去除蛋白、多糖、 多酚等雜質(zhì) 重新沉淀DNA DNA， 重新沉淀DNA，讓酒精 充分揮發(fā) 增加70 70％ 增加70％乙醇洗滌的 次數(shù)（ 次數(shù)（23次） 加入RNase降解RNA RNase降解 加入RNase降解RNA DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題二：DNA降解 降解。 原 因 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 材料不新鮮或反復(fù)凍 融 未很好抑制內(nèi)源核酸 對(duì) 酶的活性 提取過(guò)程操作過(guò)于劇 策 DNA被機(jī)械打斷 烈，DNA被機(jī)械打斷 外源核酸酶污染 反復(fù)凍融 4. 5. 盡量取新鮮材料， 盡量取新鮮材料，低溫保存材料避 免反復(fù)凍融 液氮研磨或勻漿組織后， 液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍 前加入裂解緩沖液 在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料 DNA時(shí) 的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑 的含量， 的含量，細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng) 盡量輕柔 所有試劑用無(wú)菌水配制， 所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高 溫滅菌 DNA分裝保存于緩沖液中 分裝保存于緩沖液中， 將DNA分裝保存于緩沖液中，避免 反復(fù)凍融 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題三：DNA提取量少 提取量少。 原 因 1. 2. 3. 4. 1. 2. 實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 吸附或沉淀不完全 洗滌時(shí)DNA丟失 洗滌時(shí)DNA丟失 DNA 對(duì) 策 3. 4. 盡量選用新鮮（幼嫩）的材 盡量選用新鮮（幼嫩） 料 動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分； 動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或機(jī)械方式破壁。高溫裂解 時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng) 時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（ 物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK PK的用 物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用 量）。 經(jīng)常更換新手套。 ，會(huì)導(dǎo)致 污染。 使用滅過(guò)菌的塑料制品和槍頭避免交叉污染。玻璃器皿可在 應(yīng)使用不含 的塑料和玻璃器皿。 。 酶抑制劑 異硫氰酸胍：目前是最有效的 酶抑制劑， 異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時(shí)也使 酶抑制劑 RNA酶失活。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)， 酶失活 RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。 酶有強(qiáng)烈的變性作用 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物， 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和 RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。 酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類物質(zhì) 酶的活性 RNA酶的蛋白抑制劑（RN
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