ecoli感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)化、提取與酶切鑒定-在線瀏覽
2025-02-22 02:56本頁面
【正文】 的核苷酸序列，如EcoR I識(shí)別與切割序列為 5`GAATTC3` 3`CTTAAG5` (2) 、識(shí)別的核苷酸數(shù)目大多數(shù)為 4～ 6個(gè)，少數(shù)識(shí)別8～ 13個(gè)； (3)、識(shí)別序列大多數(shù)為 二重對(duì)稱（回文序列） ，大多數(shù)酶產(chǎn)生的是具有凸出的 粘性末端 ： (4)、有不同來源的限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別相同的序列，甚至切割的位點(diǎn)也相同，稱為 同裂酶 或 異源同工酶 ，如Hpa II與 Msp I；有的識(shí)別位點(diǎn)不同，但對(duì) DNA切割后可產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為 同尾酶 ，如 BamH I與 Bgl II。 瓊脂糖凝膠電泳 : 瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶具有一定形狀、大小與孔隙度的固體基質(zhì) (密度與瓊脂糖濃度相關(guān) )；而生理?xiàng)l件下，核酸分子的糖 磷酸骨架中磷酸基團(tuán)呈 離子化 狀態(tài)，因此將核酸分子置于電場中時(shí)，它們會(huì)向正極遷移，由于糖 磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性，相同數(shù)量的雙鏈 DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以同樣的速度向正極方向遷移。 分子量較小的 DNA分子，比分子量較大的 DNA分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以 其電泳遷移速率也就比同等分子量的松散型的開環(huán) DNA分子或線性 DNA分子要快 。 影響瓊脂糖凝膠電泳 DNA遷移率的因素： DNA的分子大小； 瓊脂糖濃度； DNA構(gòu)象； 電場強(qiáng)度； 堿基組成與溫度；嵌入染料的存在；電泳緩沖液的組成。g／ mL濃度 50100181。 四．操作步驟 : (一 ) 感受態(tài)細(xì)胞的制備： 從新活化的 DH5α 平板上挑取一 單菌落 ，接種于 3～ 5ml LB液體培養(yǎng)中 ， 37℃ 振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期 (12h左右 )； 將該菌懸液以 1:100～ 1:50轉(zhuǎn)接于 100ml LB液體培養(yǎng)基中 ， 37℃ 振蕩擴(kuò)大培養(yǎng) ， 當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后 ， 每隔 20～ 30min測一次 OD600， 至 OD600為 ～ 止培養(yǎng) ， 并轉(zhuǎn)裝到 mL離心管中； 培養(yǎng)物于冰上放置 20min； 0～ 4℃ ， 4000g離心 10min，棄去上清液，加入 1 mL冰冷的 ／ L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞 , 冰浴 20分鐘； CaCl2純度至關(guān)重要，不同廠家， 甚至同一廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品均影響感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率 0～ 4℃ ， 4000g離心 10min， 倒凈上清培養(yǎng)液 ，再用 mL冰冷的 ／ L CaCl2溶液 輕輕懸浮 細(xì)胞 ，冰浴 20min； 0～ 4℃ ， 4000g離心 10min， 棄去上清液，加入100 181。 （二）質(zhì)粒 DNA的轉(zhuǎn)化： 每 100181。L質(zhì)粒 DNA,輕輕搖勻，同時(shí)設(shè)置三組對(duì)照： (1)不加質(zhì)粒， (2)不加受體菌， (3)加已知具有轉(zhuǎn)化活性的質(zhì)粒 DNA， 具體操作按下表進(jìn)行： *陽性對(duì)照，用已知具有轉(zhuǎn)化活性的 pGEXPDIPr質(zhì)粒 DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化 編號(hào) 組 別 質(zhì)粒 DNA/μL TE buf / μL 1 受體菌對(duì)照 —— 1 —— 100 2
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