實(shí)驗(yàn)三、質(zhì)粒dna的酶切-在線瀏覽
2024-09-25 21:25本頁面
【正文】 （嘌呤）甲基化 。 ? Ⅱ 類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割，產(chǎn)生 平末端的 DNA片段 (如 SmaⅠ:5 ‘CCC↓GGG 3’)；有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生 帶有單鏈突出末端（ 3 ’突出和 5 ’突出的單鏈末端 ）的 DNA片段稱粘性未端 ，如 EcoRⅠ 、 PstⅠ 切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。…G↓AATTC…339?！?G AATTC…339?！瑿TTAA↑G …539?！?CTTAA G…5 ’ SmaⅠ :5 ’ CCC↓GGG3’ →539?！璆GG CCC..5’ ? Ⅱ 類限制性內(nèi)切酶可分四類： ：是不同來源分離得來的不同酶，它們有相同的識(shí)別序列，切割方式可以相同，也可不同。 SmaI 和 XmaI識(shí)別序列相同，但切割位點(diǎn)和方式不同，前者產(chǎn)生平末端，后者產(chǎn)生 5‘粘性末端。 Subset酶之間可以代替使用， 2個(gè)Subset酶消化的 DNA片段，可以相互連接，連接后的重組 DNA分子，可以被其中一種酶識(shí)別，或均不能識(shí)別。在基因工程中有一定的應(yīng)用價(jià)值。 在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下（包括溫度、 pH、離子強(qiáng)度等）， 1小時(shí)內(nèi)完全酶解 1ug特定的 DNA底物所需要的限制性內(nèi)切酶的量， 定義為 1個(gè)活性單位 （ 1U)。 ? 限制性內(nèi)切酶對(duì)于 DNA底物的酶解是否完全與正確，直接關(guān)系到 DNA連接、基因克隆分子篩選和鑒定等實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 ? 大部分限制性內(nèi)切酶不受 RNA或單鏈 DNA的影響。 ? DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性 ： DNA純度 ，在 DNA樣品中若含有蛋白質(zhì)，或沒有去除干凈制備過程中所用的乙醇、 EDTA、 SDS、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子，均會(huì)降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。使用所有限制酶均有可發(fā)揮活性的一種緩沖液。據(jù)此可分為高鹽、中鹽和低鹽緩沖液。 酶切消化反應(yīng)的溫度 ， DNA消化反應(yīng)的溫度，是影響限制內(nèi)切酶活性的一個(gè)重要因素。多數(shù)限制內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度是 37℃ ，少數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度高于或低于 37℃ 。有些限制酶在消化它們自己的處于不同部位的限制位點(diǎn)，其效率也有明顯差異，這種現(xiàn)象稱內(nèi)切酶的底物位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)效應(yīng)。 Y=C, T。 K= G, T。 W=A, T。 B=G, T, C。 D=G,A,T。酶切完成后，不必立即進(jìn)行終止反應(yīng)，可先取出適量反應(yīng)液進(jìn)行快速的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察酶切結(jié)果，再?zèng)Q定是否終止反應(yīng)。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同，各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度 (大多數(shù)為 37℃) 。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加 25倍，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)， 但過分加大酶量，甘油會(huì)影響反應(yīng)外，酶本身會(huì)導(dǎo)致識(shí)別序列的特異性下降 ,產(chǎn)生酶的星號(hào)活力 。每一種酶在特別的條件下均會(huì)產(chǎn)生這種活力。 產(chǎn)生星號(hào)活力的原因：高甘油含量、酶量過大、低離子強(qiáng)度、高 pH（ ）、含有有機(jī)溶劑、非 Mg2+的二價(jià)離子存在。 二、 材料 1． DNA底物 λDNA 或 重組質(zhì)粒 DNA或制備的植物組織 DNA。 Tip頭 三、 試劑 1． 5 TBE電泳緩沖液：稱取 Tris 54 g，硼酸 g，并加入 EDTA () 20ml，定溶至 1000 ml。 2．溴酚藍(lán)指示劑溶液 (6 上樣緩沖液 )稱取溴酚藍(lán) 100 mg，加雙蒸水 5 ml，在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖 25 g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍(lán)溶液中，搖勻后定容至 50 ml，加入 NaOH 1滴，調(diào)至藍(lán)色。 4． DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)需要購(gòu)買，一般濃度為 μg/μl 。①酶切后不需進(jìn)行下一步反應(yīng)，可加入含 EDTA的終止液終止反應(yīng)；②若需進(jìn)一步反應(yīng) (如連接，切割等 )，可將反應(yīng)管置 65℃ 保溫 2030分鐘，以滅活酶終止反應(yīng)；③可用酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀獲得較純 DNA或 割膠回收 DNA進(jìn)行下一步酶學(xué)操作 。 膠板的制備：將冷卻至 60℃ 左右的瓊脂糖凝膠液，緩慢倒入內(nèi)槽，直至所需厚度，注意不要形成氣泡，特別是梳子下，如有氣泡可用牙簽挑破。 加
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