xxxx年本科實驗四重組質(zhì)粒dna提取、雙酶切鑒定-wenkub
2023-02-02 11:10:26 本頁面
【正文】 粒的原理、步驟及各試劑的作用 。通常是將單個基因?qū)胨拗骷?xì)胞中復(fù)制而成。 基因工程 ?定義： 實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為基因工程，又稱重組 DNA技術(shù)。 ?掌握 核酸內(nèi)切酶切割 質(zhì)粒的原理并 學(xué)會運(yùn)用內(nèi)切酶 一 .質(zhì)粒 DNA的提取 1 關(guān)于質(zhì)粒的概念 （ plasmid）？ ？ ？ ？ ？ 8 質(zhì)粒的定義 質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的 環(huán)狀雙鏈 DNA分子 ，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。 電泳時，三者泳動速度大小關(guān)系（？？？） 12 最快 中 最慢 質(zhì)粒 DNA的基本特征： (1) 自主復(fù)制性 ：能獨(dú)立于染色體 DNA外自主復(fù)制； (2) 可擴(kuò)增性 ：嚴(yán)緊型復(fù)制 復(fù)制 15個拷貝 松弛型復(fù)制 復(fù)制數(shù)十個拷貝； (3) 可轉(zhuǎn)移性 ：通過細(xì)菌結(jié)合作用從一個宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個宿主細(xì)胞； (4) 不相容性 ：具有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)特征的兩種不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定地存在于同一受體細(xì)胞內(nèi)。 2 提取大腸桿菌質(zhì)粒 DNA的 方法和原則 分離純化質(zhì)粒 DNA的主要步驟 (1)培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增 （ DNA的擴(kuò)增與選擇 ） (2)細(xì)菌的收集與裂解 ? 收集方法：高速離心的方法 ? 裂解細(xì)菌方法：去污劑法、有機(jī)溶劑法、 堿變性法 、 沸水 熱裂法、溶菌酶法、超聲處理法等。 ①質(zhì)粒 DNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀； ②雙鏈 DNA并不完全分離。 實 驗步驟 加 EP管， 12023rpm 1min，去上清， 再加 ， 12023rpm 1min，去上清 加入冰的 200 181。l到新 EP管，加入等體積 500181。l上層水相轉(zhuǎn)移到新的 EP管 ，加入 2倍體積 800181。 切割不同來源的 DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價值（ “ 分子手術(shù)刀 ” ）。G A A T T C3‘ 339。 339。 (3)反應(yīng)緩沖液。 Hind III PUC1
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