質粒dna制備-wenkub
2022-08-29 14:25:24 本頁面
【正文】 用細菌原有的酶系進行復制 ? 質粒含有復制起始點，此起始點及順式作用調控元件組成一個復制子 (replicon)，能利用細菌染色體 DNA復制所用的同一套酶系統(tǒng)，在細菌細胞中獨立地進行自我復制及轉錄。 ? 質粒 依賴于宿主編碼的酶和蛋白質來進行復制和轉錄 。 ? 已經(jīng)在形形色色的細菌類群中發(fā)現(xiàn)質粒 . ? 這些質粒都是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位 。 ? 質粒通過細菌間的接合作用 ， 從雄性體轉移到雌性體 ， 是細菌有性繁殖的性因子 ． ? 1946年 ， Lederburg和 Fatum發(fā)現(xiàn)的 F因子是最早發(fā)現(xiàn)的質粒 ， F因子與高等生物細胞質中的染色體外遺傳單位極為相似 。 通常 ， 質粒含有編碼某些酶的基因 ， 這些酶事實上在一定的環(huán)境下對細菌宿主有利 。 ? 根據(jù)所含復制起始區(qū)的不同，有些質粒的復制與宿主細胞染色體的復制同步，每個細胞只含有一個或幾個拷貝的質粒，即處于 “ 嚴密控制 ” 。 ? 由于質粒分子是從細胞內的質粒庫中隨機選取出來進行復制的 ， 所以兩個不同的質粒在一個單細胞中的拷貝數(shù)并不總能保持相同 。 ? 通過檢查不同質粒在同一細胞中共存的能力，可以把它們分為若干不相容組。 5. 選擇的標記 ? 質粒應帶有一個或幾個可供選擇的標記，便于對轉化株的篩選。 ? 大腸桿菌的 lac Z基因也常被用作為選擇的標記 ，此基因編碼半乳糖苷酶 ， 能分解一種有色基因(x)與半乳糖以糖苷鍵連結成的化合物 xgal。 ? 若這種單一的限制性內切酶位點處于選擇標記基因的內部，外源基因片斷插入后會導致該基因失活便于篩選。 3．表達載體 ? 載體含有 tac啟動子 、 Lac操縱基因 、SD序列 、 Lac I阻遏蛋白基因等 。 ? 對于新一代的質粒如 pUC系列等，由于宿主對這些松弛型質粒的復制控制不嚴，利用氯霉素對質粒 DNA的選擇性擴增并不十分必要。 ? 這種低效率擴增 ， 可利用高營養(yǎng)培養(yǎng)基促進生長 ， 一般可增加質粒產(chǎn)量 46倍 。 3．質粒 DNA純化 ? 質粒從細菌中分離出來以后，為滿足有些實驗的要求還應進一步純化。 ? 轉基因動物，真核細胞轉染及 DNA外切酶酶切缺失等實驗，對閉合環(huán)狀雙鏈 DNA的要求較高，一般還是用超速離心法純化質粒。 ? 另外 ， HB101及其它含有 endA+基因型的菌株表達中的核酸內切酶 A， 在煮沸時不能完全失活 ， 在以后操作中 ，只要有 Mg2+存在 (如內切酶反應緩沖液 )，核酸內切酶 A就可將質粒 DNA
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