質(zhì)粒酶切鑒定ppt課件-wenkub
2023-06-10 00:15:01 本頁面
【正文】 單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過 DNA連接酶的作用而 “ 粘合 ” 。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或 6個核苷酸，少數(shù)也有識別 5個核苷酸以及 7個、 8個、 9個、 10個和 11個核苷酸的。這類酶如 EcoB、 EcoK等。 各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割 DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶， 它們以此來限制外源 DNA存在于自身細胞內(nèi)，但合成 這種酶的細胞自身的 DNA不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的 DNA進行了修飾，限制性酶對修飾過的 DNA不能起作用。 2. 相關(guān)基礎(chǔ)知識 限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈 DNA分子特異性核酸序列的 DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。 這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。 第二類 (II型 )限制性內(nèi)切酶 能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。 II 型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向 “ 讀 ” 都完全相同。 II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。但這幾個核苷酸對不是特異性的。例如 HpaⅡ 和 MspⅠ 的識別順序都是5’……G’CG_G……3’ ， 如果其中有5’ 甲基胞嘧啶，則只有 HpaⅡ 能夠切割。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新的 4核苷酸的酶切位點，即 Bfa1的酶切位點 。5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素(1) DNA的純度；(2) DNA的甲基化程度；(3) 酶切消化反應(yīng)的溫度；(4) DNA的分子結(jié)構(gòu)；(5) 溶液中離子濃度及種類；(6) 緩沖液的 pH值。瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率，因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的 DNA片段。 它能夠插入 DNA分子中的堿基對之間而與 DNA結(jié)合。3. 實驗材料與儀器? 質(zhì)粒 pCMVMycT10? NEB 標準分子量片段 (1kb DNA Ladder)? EcoR1 和 Xho1 核酸內(nèi)切酶（ Takara）? EcoR 1和 Xho 1酶 解緩沖液 (10H buffer)? 瓊脂 糖? TBE或 TAE緩沖液 (10)? 溴化乙啶染色液 (10mg/ml)? 上樣液
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