質(zhì)粒酶切鑒定ppt課件(存儲(chǔ)版)
【正文】 負(fù)電的核酸分子就可以向陽極遷移。可以檢測(cè) 10ng 的 DNA。因?yàn)椴煌拿杆蟮淖钸m反應(yīng)條件不同，所以一定要使用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。 將冷卻至 65℃ 左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。為了獲得電泳分離 DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于 5V/cm（ 兩電極間的距離）。對(duì)于未進(jìn)行酶切的質(zhì)粒來說，常會(huì)出現(xiàn)兩條電泳帶，一條是（松弛）螺旋狀質(zhì)粒 DNA帶，另一條是超螺旋狀質(zhì)粒 DNA的帶， 以超螺旋狀質(zhì)粒 DNA居多，移動(dòng)速度也最快。在紫外燈下觀察時(shí)，應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃防護(hù)面罩，避免眼睛遭受強(qiáng)紫外光損傷。1 kb DNA ladder（ 共 10條帶） : 在第一個(gè)上樣孔或最后一個(gè)上樣孔內(nèi)加入 6?l 的 1 kb DNA ladder（ 50ng/?l ）。1) 質(zhì)粒 DNA的酶解（自提質(zhì)粒 pCMVMycT10）2) 瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠液的制備：稱取 ，置于三角瓶中，加入 100ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯等 ，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。AATT_CXho I 酶切位點(diǎn)： C39。 它能夠插入 DNA分子中的堿基對(duì)之間而與 DNA結(jié)合。5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素(1) DNA的純度；(2) DNA的甲基化程度；(3) 酶切消化反應(yīng)的溫度；(4) DNA的分子結(jié)構(gòu)；(5) 溶液中離子濃度及種類；(6) 緩沖液的 pH值。例如 HpaⅡ 和 MspⅠ 的識(shí)別順序都是5’……G’CG_G……3’ ， 如果其中有5’ 甲基胞嘧啶，則只有 HpaⅡ 能夠切割。 II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。 第二類 (II型 )限制性內(nèi)切酶 能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。 各種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割 DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶， 它們以此來限制外源 DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成 這種酶的細(xì)胞自身的 DNA不受影響，因?yàn)檫@種細(xì)胞還合成了一種修飾酶，對(duì)自身的 DNA進(jìn)行了修飾，限制性酶對(duì)修飾過的 DNA不能起作用。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見的是4個(gè)或 6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)
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