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藥物遺傳毒性和致癌性研究現(xiàn)狀和動向-在線瀏覽

2025-01-30 19:35本頁面
  

【正文】 S2A+S2B FDARedbook Redbook 2023: ShortTerm Tests for Geic Toxicity July 2023 Redbook 2023: Bacterial Reverse Mutation Test Redbook 2023: In vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test Redbook 2023: Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Gene Mutation Assay Redbook 2023: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test FDACDER FDACDER EMEA EMEA EMEA Step 2 Step 1 Step 3 Step 4 2023 2023 2023 2023~2011 ? ICH SC 同意啟動修訂工作 ? 2023. 10 ICH EWG 討論籌劃修訂方法 ? 2023. 05 對修訂內(nèi)容達(dá)成一致意見,開始起草S2(R1) ? 2023. 10 完成起草的 S2(R1) ? 2023. 02 簽署 S2(R1),完成step 2 ? 2023. 06 審議意見,回答公共注釋 ? 2023. 11 未按期開會(未獲得彗星試驗(yàn)數(shù)據(jù)) ? ? 體內(nèi)試驗(yàn)單次和重復(fù)給藥方案都接受 ? FDA對 取消體外細(xì)胞試驗(yàn)或降低最高濃度和細(xì)胞毒性 提出異議 ? S2(R1)正式頒布 遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)的修訂 2023~2011 ICH S2A+S2B=S2(R1) S2R1 的修訂宗旨: ?減少體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn)的假陽性 ?動物試驗(yàn) 3R原則(替代、減少和優(yōu)化) In vivo: 建議整合入重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)中 每次實(shí)驗(yàn)不必使用平行的陽性對照 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測 ICH S2A+S2B=S2(R1) 遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)的修訂 S2B S2R1 選擇一 選擇二 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn) ( with repeat) 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn) ( No repeat) 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn) ( No repeat) 體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn): CA / MLA 10mM Cell growth:?50% / RTG: ? 80% 體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn): CA / MLA / MN 1mM ≤50%/ ≥80% 無 體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn) 體內(nèi)微核試驗(yàn) (單獨(dú)一項且是急性毒性試驗(yàn)) 體內(nèi)微核試驗(yàn) (整合至一般毒理試驗(yàn)中) 一項體內(nèi)微核試驗(yàn) + 一項體內(nèi)不同檢測終點(diǎn) /組織試驗(yàn)(肝 Comet試驗(yàn)) (整合至一般毒理試驗(yàn)中或聯(lián)合在同一個試驗(yàn)) 整合試驗(yàn)的最高劑量和暴露 ICH S2(R1)修訂小結(jié) S2A和 S2B整合入一個指導(dǎo)原則中; 提供可選擇的遺傳毒性試驗(yàn)組合; 減少 體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn)不相關(guān)的陽性; 體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)可以 整合 入重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中; 無需每一項體內(nèi)試驗(yàn)都設(shè)同步的陽性對照; 體外細(xì)菌突變試驗(yàn)無需重復(fù)試驗(yàn)。 ICH S2(R1) Pfuhler S. et al. 2023 藥物遺傳毒性評價的指導(dǎo)原則 1 遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究 2 藥物致癌性評價的概要 3 傳統(tǒng)和替代致癌試驗(yàn)的研究 4 4 主要內(nèi)容 遺傳毒性傳統(tǒng)試驗(yàn)方法 3 1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)( Ames試驗(yàn)) 人工誘變的突變株在組 /色氨酸操縱子中有一個突變,突變的菌株必須依賴外源性組 /色氨酸才能生長,而在無組 /色氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活,致突變物可使其基因發(fā)生回復(fù)突變,使它在缺乏組 /色氨酸的培養(yǎng)基上也能生長。 Ames試驗(yàn) 預(yù)培養(yǎng)法 將下列物質(zhì)在冰浴上混合: mL S9混合液或 mL磷酸緩沖液 (大約 10^8菌量) mL受試物溶液(或?qū)φ眨軇┖完栃詫φ瘴锶芤海? 將該混合液在 37℃ 下培養(yǎng) 20分鐘(水浴中) 然后加入 2mL含有 %瓊脂、 % NaCl、 mM生物素和 L- 組胺酸的融溶頂層培養(yǎng)基,鋪至基礎(chǔ)培養(yǎng)瓊脂表面( VB培養(yǎng)基 E),在 室溫下凝固。處死,放血,無菌取肝組織,勻漿,經(jīng) 9000g離心 10分鐘后的上清液部分為 S9。 Ames試驗(yàn) 結(jié)果觀察和判定 計數(shù)突變菌落數(shù)-致突變性 觀察背景菌斑-毒性 判斷是否具有致突變性 Ames試驗(yàn) 假設(shè)的證明 無組氨酸的 VB平皿 7個克隆來自 0對照平皿 劃線 7個克隆 來自 1000 ug/皿處理組 劃線 全部生長 : 克隆為組氨酸 回復(fù)突變克隆 無生長: 克隆 不是 組氨酸 回復(fù)突變克隆 Ames試驗(yàn) —案例 1 ?測試系統(tǒng) 哺乳動物細(xì)胞: CHL, CHO 人外周血淋巴細(xì)胞 ?細(xì)胞核型 遺傳毒性試驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn) 3 2 染色體畸變試驗(yàn) (CA) 劑量設(shè)置 ?陰性對照組 /溶劑對照組; ?受試物至少三個劑量組; ?陽性對照組; 染色體畸變試驗(yàn) 方法 ?細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng); ?受試物處理; ?加入秋水仙素,使細(xì)胞停止于分裂中期; ?收獲細(xì)胞,滴片 ?空氣干燥,染色 染色體畸變試驗(yàn) ?包括代謝活化和非代謝活化條件 ?在處理后 6和 24小時收獲細(xì)胞 ?代謝活化條件下,受試物處理時間為 3小時 染色體畸變試驗(yàn) 處理條件 讀片分析 ?有絲分裂指數(shù)-毒性 ?染色體結(jié)構(gòu)畸變 ?染色體數(shù)目畸變 染色體畸變試驗(yàn) ?試驗(yàn)系統(tǒng) 小鼠淋巴瘤 L5178Y TK+/細(xì)胞 ?既能夠檢測點(diǎn)突變,也能夠檢測出大的染色體損傷 ?自發(fā)突變率高,需要定期清除自發(fā)突變。但張立實(shí)和 Honma等的研究表明,使用長時間 (24或 48小時 )處理可顯著提高 MLA對某些染色體斷裂劑和紡錘體毒物的檢出率。 二者均為胸苷類似物 , 都能被胸苷激酶磷酸化 , 其磷酸化產(chǎn)物摻入 DNA 可導(dǎo)致 tk+/ 細(xì)胞死亡 。 因此 , 現(xiàn) TFT已基本取代了 BUdR, 成為 TK基因突變試驗(yàn)的常規(guī)選擇劑 。在平皿中生長的抗性突變細(xì)胞集落呈近似正態(tài)分布,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計算克隆效率( cloning efficiency, CE)和突變率( mutation frequency, MF)等指標(biāo)。在微孔中生長的抗性突變細(xì)胞集落呈 Poisson分布,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計算接種效率( plating efficiency, PE)和突變率等指標(biāo)。 ?微孔平板法:大集落 ≥ 微孔直徑的 1/4 小集落<微孔直徑的 1/4 ?軟瓊脂平皿法:大集落直徑 ≥ 小集落直徑< ?大集落呈彌散性生長,其密度低;小集落呈集中性生長,其密度高。 大集落 突變體的基因損傷多僅局限于 tk 位點(diǎn)(即小范圍的 點(diǎn)突變 );而 小集落 突變體是 由較大范圍的 染色體改變 (染色體斷裂、缺失、重組或分離異常等)所致。但關(guān)于兩類集落產(chǎn)生的確切機(jī)制及其意義,還有待進(jìn) 一步的研究。(微孔法中的GEF=99+27=126) 陽性對照參考值 ? 其一,陽性對照組總誘導(dǎo)率IMF至少 ≥300 106,其中小克隆 IMF至少 ≥120 106 ? 其二,小克隆 IMF至少≥150 106 ? 滿足上述標(biāo)準(zhǔn)之一,并且陽性對照相對總生長率 ( RTG) ≥10% 結(jié)果評
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